1、 猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的研制猪传染性胸膜肺炎菌影疫苗的研制王春来细菌动物病创新团队中国农业科学院哈尔滨兽医研究所猪病论坛 深圳 2019.04.29概 述 病 原 菌：胸膜肺炎放线杆菌（APP）疾病特征：肺脏出血、坏死以及与胸膜 发生纤维素性粘连 危 害：世界范围内的多发病、常见病 规模化猪场猪呼吸系统综合征 （PRDC）的主要病原之一急性爆发：致死率可高达100慢性感染：高发病率，患猪表现为生长迟 滞、饲料利用率低、日增重明显 下降等，可谓损失巨大。APP 包括15个血清型，各个血清型间毒力差异较大，但引起的疾病症状相同。主要毒力因子：Apx毒素（Apx、Apx、Apx 和Apx）荚膜多
2、糖（CP）脂多糖内毒素（LPS）外膜蛋白（OMP）转铁蛋白结合蛋白（Tbp）粘附素（Adhesin）蛋白酶（Protease）铁摄取调控因子（Fur）我国APP疫苗研究进展 灭活苗(全菌体通过加热或用甲醛灭活后制备的一种疫苗)血清1、2、7型三价苗（武汉科前）血清1、3、7型三价苗（中农威特）血清1、7二价苗（山东华宏）亚单位疫苗（APP主要毒力因子及保护性抗原为主要组分的疫苗）保猪利爱普克（Porcilis APPR,Intervet）（Apx Apx Apx OMP）哈尔滨兽医研究所（目前处于临床前研究阶段）弱毒活疫苗（人工缺失或灭活某一种或几种毒力因子致弱的活疫苗）华中农业大学（APP1
3、apxICapxIICORF1，注册新兽药证书）哈尔滨兽医研究所（APP7clpPapxIICfur，申报转基因安全评价）Ghost（菌影）疫苗（细菌裂解后剩下的空壳制备的一种疫苗）哈尔滨兽医研究所目前处于临床前研究阶段 疫 苗 优 点 缺 点 灭活苗安全，易于生产同型保护，交叉保护性差，只能减少死亡率，不能阻止感染和发病 亚单位疫苗包含毒素等分泌性成分，交叉保护性好生产过程繁琐，成本高 弱毒活疫苗免疫原性及交叉保护性好，能够阻止APP在呼吸道定居安全性差，有返祖的可能，因为APP毒力因子众多，只缺失一个或几个毒力因子尚不能使毒力减弱到安全使用的水平，所以目前尚无一种活疫苗被批准上市Ghost
4、（菌影）疫苗兼具灭活苗的安全性和活苗的有效性，能够阻止APP在呼吸道定居 未知 猪传染性胸膜肺炎菌影猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗的研制疫苗的研制Ghost（菌影）简介n近年来出现的一种新概念、新技术n一种没有细胞浆和核酸的空细菌体 n利用噬菌体X174 裂解基因E 在革兰氏阴性细菌中表达后，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和胞壁上可形成穿膜孔道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌内细胞浆和核酸等成分通过此孔道被排出，形成的一种空的细菌外壳，即为“菌影”，也称“菌蜕”。Ebensen et al.,J Immunol,2019Witte et al.,J Bacteriol,1990扫描电镜透射电
5、镜Ghost 制作流程示意图提取提取 DNA 28 42 目前，国外已经成功制备成菌影的细菌包括大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、支气管败血博特氏杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌等。说明只要具备合适的遗传操作系统，基于噬菌体裂解基因的裂解系统几乎适用于所有的革兰氏阴性细菌。目前我们实验室已成功制备了胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的菌影。Ghost疫苗的优点 是一种基因工程死苗，不含任何核酸成分，安全；由于ghost疫苗利用的是基因工程方法使菌体裂解灭活，没有经过物理或化学的变性过程（如甲醛灭
6、活处理），所以菌体表面构象与活菌相似，提呈的是天然抗原决定簇，免疫原性好；可以激发特异的体液免疫和细胞免疫应答；交叉保护能力优于灭活苗；优良的佐剂效应，菌影细胞表面含有脂多糖和肽聚糖，具有佐剂作用；诱导的免疫反应水平达到或超过福氏完全佐剂；生产工艺简单，不需添加佐剂，可冻干保存，不需冷链条件运输和保存。App及菌影透射电镜照片正常正常APP细菌细菌APP 菌影菌影重组菌株重组菌株APP1（pGZRS-E）正常正常APP细菌细菌 APP 菌影菌影App及菌影扫描电镜照片批次批次接种剂量接种剂量（CFU）猪数猪数猪体反应猪体反应体温体温 体重体重 1X109 5精神、食欲正常 正常 正常10060
7、6 1X1010 5精神、食欲正常 正常 正常 1X1011 5精神、食欲正常一过性升高 正常 1X109 5精神、食欲正常 正常 正常100612 1X1010 5精神、食欲正常 正常 正常 1X1011 5精神、食欲正常一过性升高 正常正常剂量及大剂量免疫情况App ghost对断奶仔猪的安全性试验 App ghost不同剂量免疫对仔猪体温的影响 App ghost不同剂量免疫对仔猪体重的影响App ghost对怀孕母猪的安全性试验批次接种剂量（CFU）猪数猪体反应体温1006061x1093精神、食欲、产仔正常正常1x10103精神、食欲、产仔正常正常1006121x1093精神、食欲、
8、产仔正常正常1x10103精神、食欲、产仔正常正常正常剂量及大剂量免疫情况 App ghost不同剂量免疫对怀孕母猪体温的影响App ghost免疫效力试验 45头头4-6周健康断奶仔猪周健康断奶仔猪App ghost（BGs,15头）头）灭活苗（灭活苗（IB,15头）头）PBS 对照组（对照组（PC,15头）头）免疫免疫2次，间隔次，间隔2周，周，1ml/头（头（510 9 CFU/ml）2免后免后14天用天用App 1、5、7型气管攻毒，型气管攻毒，5头头/组组/型，型，1ml/头，头，1x107-8CFU/ml0、7、14、21、28、35天分别采血天分别采血攻毒后死亡猪剖杀，攻毒后死亡
9、猪剖杀，14天存活猪天存活猪采血、剖杀采血、剖杀 脏器细菌载量脏器细菌载量病理组织学观察病理组织学观察 数据分析数据分析*与对照比相比差异显著（P0.05）；*与对照比相比差异极显著（P0.01）；*与对照比相比差异极显著（P0.001）；与灭活苗组相比差异显著（P0.05）；与灭活苗组相比差异极显著（P0.01）IgG免疫后抗体动态变化 攻毒细胞因子产生情况IFN-*与对照比相比差异显著（P0.05）；*与对照比相比差异极显著（P0.01）；*与对照比相比差异极显著（P0.001）；与灭活苗组相比差异显著（P0.05）；与灭活苗组相比差异极显著（P0.01）*IL-4 攻毒 攻毒*与对照比相
10、比差异显著（P0.05）；*与对照比相比差异极显著（P0.01）；与灭活苗组相比差异显著（P0.05）*T淋巴细胞亚类 攻毒 攻毒攻毒保护情况APP1攻毒 组别组别 临床症状临床症状 发病数发病数 死亡数死亡数 保护率保护率 肺损伤肺损伤App ghost（BGs）呼吸正常或呼吸率增加 1 0 80%（1/5）灭活苗 （IB）体温升高，咳嗽 2 0 60%（3/5）对照组 （PC）体温升高，咳嗽，呼吸困难 5 4 0%(5/5)：125%肺损伤；：2650%肺损伤；：5175%肺损伤；：76100损伤攻毒保护情况APP5攻毒 组别组别 临床症状临床症状 发病数发病数 死亡数死亡数 保护率保护率
11、 肺损伤肺损伤App ghost（BGs）呼吸率增加，体温升高 2 0 60%（3/5）灭活苗 （IB）体温升高，咳嗽，呼吸困难 4 1 20%（1/5）对照组 （PC）体温升高，咳嗽，呼吸困难 5 5 0%(5/5)：125%肺损伤；：2650%肺损伤；：5175%肺损伤；：76100损伤攻毒保护情况APP7攻毒：125%肺损伤；：2650%肺损伤；：5175%肺损伤；：76100损伤 组别组别 临床症状临床症状 发病数发病数 死亡数死亡数 保护率保护率 肺损伤肺损伤App ghost（BGs）呼吸正常或呼吸率增加 2 0 60%（3/5）灭活苗 （IB）体温升高，咳嗽，呼吸困难 3 1 4
12、0%（2/5）对照组 （PC）体温升高，咳嗽，呼吸困难 5 3 0%(5/5)临床病理变化 App ghost免疫组 灭活苗免疫组 对照组肺脏组织病理变化 App ghost免疫组 灭活苗免疫组 对照组肺脏免疫荧光检测 对照组 灭活苗免疫组 App ghost免疫组hilar lymph nodeLungSpleen*与对照比相比差异显著（P0.05）；*与对照比相比差异极显著（P0.01）；与灭活苗组相比差异显著（P0.05）脏器细菌载量小结n猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗安全性好，接种后无任何不良反应。n猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗通过肌肉注射免疫猪后，可刺激机体产生较强的体液免
13、疫和细胞免疫，对App强毒菌的攻击可产生良好保护，明显优于灭活苗免疫组和对照组。n猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗已与动物用生物制品国家工程研究中心（哈尔滨）达成了合作开发的意向n很多生物制品企业对猪传染性胸膜肺炎菌影ghost疫苗感兴趣，并初步达成了成果转化的意向。副猪嗜血杆菌病副猪嗜血杆菌病ghost疫苗的研制疫苗的研制 正常Hps Hps ghostHps及菌影透射电镜照片试验进展n基本完成了实验室研究工作，正在进行转基因安全评价，已完成中间试验。结果表明，Hps ghost疫苗对靶动物猪是安全的，已申报环境释放并获得批文；n初步动物免疫试验结果表明，Hps ghost疫苗具有良好的免
14、疫效力，能够保护猪抵抗Hps强毒菌的攻击，保护效力要优于灭活疫苗。申请和获得的专利n重排噬菌体溶菌基因及其打孔载体和在制备疫苗中的应用(ZL 2009 1 0018379.5）n增强噬菌体溶菌基因打孔效率的DNA序列及其应用（ZL 2009 1 0018380.8）n突变的噬菌体裂解基因E、含有该裂解基因的裂解质粒载体和在制备菌影疫苗中的应用（申请号：201910409238.5）n一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及其产品和应用（申请号：201910409237.0）获得的转基因安全证书及安全评价n表达溶解基因E和温敏调控基因cIts857的重组放线杆菌Shope4074（pGZRS-E）基因工程菌影疫苗的安全证书（农基安证字（2019）第014号）n表达溶菌基因E和温敏调控基因cIts857的重组副猪嗜血杆菌疫苗rHps-E在黑龙江省的环境释放（农基安审字（2019）第035号）展 望nGhost疫苗兼具灭活苗的安全性和活苗的有效性；n良好的交叉保护性；n可工业化生产，工艺简单，不需冷链条件运输和保存。n前景光明，菌影疫苗的研发和推广应用必将带来细菌疫苗的一场革命。
