1、自噬抑制剂自噬抑制剂3-MA克服肝癌细胞索拉菲尼耐药克服肝癌细胞索拉菲尼耐药的作用及机制研究的作用及机制研究专业：普通外科专业：普通外科导师：王世明教授导师：王世明教授硕士研究生：梁源硕士研究生：梁源1自噬抑制剂3-MA 专业：普通外科1 立论依据 研究现状 研究方案 目录目录1234 研究基础5 参考文献2 立论依据 肝癌肝癌 肝癌是临床上最常见的肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，我国已成为恶性肿瘤之一，我国已成为全球肝癌发病率最高和死亡全球肝癌发病率最高和死亡最多的国家。我国肝癌发病最多的国家。我国肝癌发病约约347万人年，占到全万人年，占到全球的球的55；而死亡；而死亡323万万人，占全
2、球的人，占全球的45，因，因此，肝癌是一种具有此，肝癌是一种具有“中国中国特色特色”的癌症，严重地威胁的癌症，严重地威胁人民健康和生命。人民健康和生命。立论依据 研究背景（一）研究背景（一）3 肝癌 A期（早期）B期（中期）C期（晚期)D期（终末期）53.927.115.32.6按照BCLC分期，肝癌患者分布情况调查结果：诊断为肝癌患者中53为晚期4A 期（早期）B 期（中期）C 期（晚期)D 期（终末期）5 3.9 研究背景（二）研究背景（二）索拉菲尼索拉菲尼 近年来，分子靶向药物治疗肝癌已成为新的研究热点。其中索拉非尼(Sorafenib，商品名：Nexavar，多吉美)治疗肝癌在临床研究
3、中取得了突破性进展，能够有效地阻止病情恶化，明显地延长晚期肝癌患者的生存时间，成为第一个可以显著延长晚期肝癌患者生存期的系统治疗药物和新标准 立论依据5 研究背景（二）索拉菲消融术 0期PST 0,ChildPugh A级极早期（0）1 HCC 2cm原位癌早期(A)1个 HCC或3个结节2,ChildPugh C级HCC中期(B)多结节，PST 0AC期PST 02,ChildPugh AB级索拉非尼BCLC分期和治疗策略分期和治疗策略(2010)推荐索拉非尼作为晚期推荐索拉非尼作为晚期HCC标准治疗标准治疗 Alejandro F,Maria ER,Carlos R,et al.Semin
4、 Liver Dis.2010;30:61-74.6消融术 0 期P S T 0,C h i l d P u g h A 级极早期索拉非尼被各大指南推荐为标准用药美国国家综合癌症网（NCCN）肝癌临床实践指南美国肝病研究协会（AASLD）肝癌临床治疗指南巴塞罗那（BCLC）肝癌分期和治疗策略 亚太肝病学会（APASL）肝癌治疗指南原发性肝癌规范化诊治专家共识（中国）日本肝脏病学会（JSH）共识肝癌治疗策略欧洲（EASL-EORTC）肝癌临床实践指南7索拉非尼被各大指南推荐为标准用药美国国家综合癌症网（N C C索索拉拉非非尼尼34.Li Liu,et al.Cancer Res.2006;66
5、:11851-58.抑制血管生成lVEGFlPDGF抑制肿瘤细胞增殖抑制肿瘤细胞增殖（抑制种子生长（抑制种子生长）残余肿瘤细胞残余肿瘤细胞微小病灶微小病灶l循环肿瘤细胞循环肿瘤细胞抑制肿瘤血管生抑制肿瘤血管生成成（使土壤贫瘠（使土壤贫瘠）索拉非尼的双重抗肿瘤作用索拉非尼的双重抗肿瘤作用8索拉非尼3 4.L i L i u,e t a l.C a n c e r 索拉菲尼抗肿瘤作用索拉菲尼抗肿瘤作用索拉菲尼通过抑制PI3KAktmTORp70S6K信号通路的磷酸化。促进凋亡，同时激活自噬性程序性死亡。活化JNK途径诱导肝癌细胞发生自噬性细胞死亡索拉索拉菲尼菲尼9索拉菲尼抗肿瘤作用索拉菲尼通过抑制
6、P I 3 K A k t mT O R型程序性细胞死亡：凋亡型程序性细胞死亡：自噬坏死细胞死亡方式研究背景（三）自噬及凋亡的关系研究背景（三）自噬及凋亡的关系10型程序性细胞死亡：自噬坏死细胞死亡方式研究背景（三）自噬及 自噬模式图 研究背景11 自噬模式图 研究背景1 1 研究背景坏死坏死凋亡凋亡12 研究背景坏死凋亡1 2自噬及凋亡的关系1自噬抑制凋亡自噬抑制凋亡：自噬通过降解受损蛋白损伤等途径抑制凋亡。2自噬促进凋亡自噬促进凋亡：自噬自身并不引起细胞死亡，但它为凋亡小体的形成和吞噬作用提供能量，从而促进凋亡的发生。3自噬自噬及及凋亡共存并可相互转换凋亡共存并可相互转换：在自噬晚期使用特
7、异性自噬抑制剂则使自噬性死亡转向凋亡，有文献报道imatinib可以致恶性神经胶质瘤细胞发生自噬性死亡，然而在自噬晚期使用自噬抑制剂可使自噬性死亡转向凋亡，而当细胞凋亡被抑制剂阻断细胞则转向自噬，此时不论抑制凋亡还是自噬，细胞均转变为另一条途径的细胞死亡。研究背景13自噬及凋亡的关系1 自噬抑制凋亡：自噬通过降解受损蛋白损伤等自噬对肿瘤的双重作用 研究背景目前对自噬对肿瘤中到底是其抑制还是保护作用仍是倍具争议。（1）一方面，自噬可以杀死杀死肿瘤细胞。（2）另一方面，自噬可以保护保护肿瘤细胞。由于肿瘤细胞具有高代谢的特点，肿瘤持续快速增大营养供应不足，自噬被激活将损伤的细胞器及蛋白降解成可利用的
8、活性成分，供给给肿瘤细胞来度过这一危机。这一过程及肝癌细胞对索拉菲尼耐药形成相关。14自噬对肿瘤的双重作用 研究背景目前对自噬对肿瘤中到凋亡凋亡自噬自噬自噬自噬肝癌索拉菲尼耐药机制（一）肝癌索拉菲尼耐药机制（一）凋亡凋亡自噬激活后，一方面，降解受损细胞器及蛋自噬激活后，一方面，降解受损细胞器及蛋白为肿瘤提供营养。另一方面抑制凋亡，减白为肿瘤提供营养。另一方面抑制凋亡，减少肿瘤细胞坏死。使得少肿瘤细胞坏死。使得癌细胞癌细胞存活存活。自噬对自噬对肿瘤形成了保护作用。该肿瘤形成了保护作用。该过程降低了肝癌细过程降低了肝癌细胞对于索拉菲尼的敏感性。胞对于索拉菲尼的敏感性。我们推测这是是我们推测这是是肝
9、癌细胞对索拉菲尼耐药形成肝癌细胞对索拉菲尼耐药形成原因之一原因之一。3MA肿瘤持续快速增肿瘤持续快速增大营养供应不足大营养供应不足1.索拉菲尼通过抑制P13KAktmTORp70S6K信号通路的磷酸化。促进凋亡，激活自噬。2.活化JNK途径诱导肝癌细胞发生自噬性细胞死亡 激活激活早期早期晚期晚期抑制抑制 研究现状干预干预15凋亡自噬自噬肝癌索拉菲尼耐药机制（一）凋亡自噬激活后，一方面2.PI3k/Akt通路的激活介导了肝癌细胞对索拉非尼的继发性通路的激活介导了肝癌细胞对索拉非尼的继发性耐药耐药 PI3k/Akt是促进细胞自噬发生的重要传导通路。PI3k可被生长因子等刺激物激活生成PIP3，再激
10、活其下游的Atk蛋白继而磷酸化其一系列底物，从而达到对细自噬的调控。该通路的激活及肿瘤细胞的耐药性的产生密切相关。研究发现耐药细胞中pAkt有明显上调。而抑制Akt的表达，则可逆转耐药细胞对索拉非尼的耐药性。该研究结果表明，PI3k/Akt通路的激活介导了肝癌细胞对索拉非尼的继发性耐药。研究现状肝癌索拉菲尼耐药机制（二）肝癌索拉菲尼耐药机制（二）16 研究现状肝癌索拉菲尼耐药机制（二）1 6.本研究构建了裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐药模本研究构建了裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐药模型，观察自噬抑制剂型，观察自噬抑制剂3-MA对裸鼠原位肝癌索拉菲对裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐药模型皮下移植瘤的作用。并检测尼耐药模型
11、皮下移植瘤的作用。并检测 PI3KAKT途径及途径及JNK途径途径相关相关蛋白水平。探讨自噬抑制蛋白水平。探讨自噬抑制剂剂3-MA是否通过是否通过上述上述途径抑制自噬，代偿性激活途径抑制自噬，代偿性激活凋亡，增加耐药肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性，对凋亡，增加耐药肝癌细胞对索拉菲尼的敏感性，对耐药性形成克服或逆转，从而抑制肿瘤生长，为临耐药性形成克服或逆转，从而抑制肿瘤生长，为临床上治疗对索菲拉尼耐药的肝癌患者的用药提供实床上治疗对索菲拉尼耐药的肝癌患者的用药提供实验依据。验依据。研究目标17.本研究构建了裸鼠原位肝癌索拉菲尼耐药模型，肝癌索拉菲尼耐药细胞株的体外培养 建立移植瘤裸鼠模型空白对照组
12、 索拉菲尼组3MA+索拉菲尼组低剂量组高剂量组高剂量组低剂量组肿瘤形态学观察 观察结束后取肿瘤组织及细胞组织绘制体质量曲 线称取肿瘤组织重量计算抑瘤率Western blotting 检测pAtk、pJNK、Caspase3表达免疫组织化学染色法检测pAk、pJNK透射电镜观察自噬体及免疫荧光检测MAP1-LC3噬水平结果分析及统计处理 研究内容及 技术路线图18 肝癌索拉菲尼耐药细胞株的体外培养 （1）统计数据用SPSS20.0 软件包进行分析。（2）实验数据均以均数标准差表示。（3）采用单因素方差分析。统计方法19 统计方法1 9（1）成功建立人肝癌细胞索菲拉尼耐药株鼠移植瘤的动物模型（2
13、）需继续查阅大量文献确定小鼠灌胃给药浓度及剂量;（3）熟练掌握干预动物给药方式。（4）检测各个指标的实验技术方法需熟练掌握；拟解决关键问题20 拟解决关键问题2 0实验室及实验器材实验室及实验器材等完备等完备、试剂的完备，已基本掌握动试剂的完备，已基本掌握动物饲养、免疫组化等试验操物饲养、免疫组化等试验操作的基本要领。作的基本要领。已参阅大量相关文献立论依据已参阅大量相关文献立论依据充分，且经费已经落实充分，且经费已经落实导师导师带领的团带领的团队进行了大量队进行了大量关于自噬的研关于自噬的研究可作为前期究可作为前期研究工作积累研究工作积累Product A 研究基础及可行性分析21实验室及实
14、验器材等完备、试剂的完备，已基本掌握动物饲养、免疫预期研预期研究成果究成果231索拉菲尼及自噬抑制剂3-MA联用可克服肝癌细胞对索拉菲尼的耐药，明显增强索拉菲尼治疗肝癌效果自噬抑制剂可逆转肝癌细胞对索拉菲尼耐药，可能通过抑制及自噬有关的PI3KAKT途径及JNK途径。发表1-2篇论文 预期研究成果22预期研究成果2 3 1 索拉菲尼及自噬抑制剂3-MA 联用可克服肝癌提出了一种新的具有潜在应用价值的辅助治疗肝癌的新思路。裸鼠体内水平研究自噬克服肝癌细胞索拉菲尼耐药作用及机制研鲜有报道 1 2本课题创新之处本课题创新之处23提出了一种新的具有潜在应用价值的辅助治疗肝癌的新思路。裸鼠体2015.0
15、1-2014.04 2015.06-2015.08查阅文献查阅文献撰写综述及开撰写综述及开题报告题报告培养细胞培养细胞,裸鼠裸鼠造模造模。各组各项指标各组各项指标的测定的测定统计分析统计分析2015.08-2015.102015.04-2015.06撰写毕业论文撰写毕业论文准备答辩准备答辩研究计划及预期进展研究计划及预期进展242 0 1 5.0 1 -2 0 1 4.0 4 2 0 1 5.0 6-2 0 1 5.支出科目支出科目 金额（万元）金额（万元）计算根据及理由计算根据及理由合计合计 0.6科研业务费科研业务费 0.02 文献检索、打印、论文装订文献检索、打印、论文装订 实验材料费实
16、验材料费 0.5 实验试剂、材料、药品实验试剂、材料、药品仪器设备费仪器设备费协作费协作费 0.05 指标检测指标检测 研究组织实施费研究组织实施费 0.03 日常研究组织日常研究组织.经费预算25支出科目 金额（万元）计算根据及理1.Wilson,G.S.,et al.,Tumoricidal effects of the JAK inhibitor Ruxolitinib(INC424)on hepatocellular carcinoma in vitro.Cancer Letters,2013.341(2):p.224-230.2.Chen,K.F.,et al.,Activation
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21、治疗中的应用.中华医学杂志,2012.92(29):p.2084-2086.15.姚超,et al.,索拉菲尼诱导的肝癌耐药细胞株的建立及其生物学特性.第三军医大学学报,2012.34(14):p.1366-1369.16.张栋,et al.,PI3K/Akt信号转导通路及卵巢癌顺铂耐药相关性的研究.天津医药,2011(04):p.361-363.17.Yang Z，Klionsky DJEaten alive：a history of maeroautophagyJNat Cell Biol，2010，12(9)：814-822 18.Mizushima NThe pleiotropic r
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