1、主要内容一、什么是地中海贫血及分布二、地中海贫血的致病机制三、地中海贫血的基因诊断四、最新的地中海贫血检测方法五、检测结果分析及报告一、什么是地中海贫血定义：定义：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋 白肽链合成减少或缺失，导致血红 蛋白的链/非链比例失衡，而引起 的一组遗传性溶血性疾病，亦称海洋性贫血。血红蛋白病血红蛋白病：由于珠蛋白基因发生缺陷，致使珠蛋 白分子的一级结构发生改变，从而导致血红 蛋白的分子结构发生改变的一组遗传性疾病。地中海贫血是最常见的血红蛋白病，珠蛋白合成障碍性贫血为国内称呼，国外不用。地中海贫血分类地中海贫血地中海贫血地中海贫血地中海贫血地中海贫血地中海贫血地中海贫血血红
2、蛋白变异体溶血性异常血红蛋白（如HbS、C等）地中海贫血样变异（如Hb CS、E等）其他异常血红蛋白（如Hb M、Coimbra等）地中海贫血分类1、按照一个单倍型上的-珠蛋白基因的功能缺陷定义0地贫（也有称地贫1）：-珠蛋白基因完全 基因记为-/丧失功能。+地贫（也有称地贫2）：-珠蛋白基因保 基因记为-/留有部分功能。地中海贫血分类 2、按照肽链内切酶分型缺失型地贫：珠蛋白肽链存在片段缺失而造 成功能缺陷非缺失型地贫：珠蛋白肽链上不存在缺失，而是 （点突变）由于基因的点突变造成的肽链功能 缺陷地中海贫血分类 3、根据基因缺失或突变个数可分为：静止型：缺失1个基因，基因型记为-/1个基因突变
3、，基因型记为/T轻型：缺失2个基因，基因型记为：-/或-/-2个基因突变，基因型记为：T/T 中间型：缺失3个基因，基因型记为：-/-缺失与突变混合，基因型为：-/T或纯合突变重型：缺失4个基因，基因型记为：-/-缺失与突变混合，基因型为：-/T地中海贫血分类1、根据肽链的功能缺失0地贫：珠蛋白基因功能完全丧失，不能合成肽链地贫：珠蛋白基因尚保留部分功能2、根据临床症状静止型地贫：突变杂合子（N/+），中国人少见轻型型地贫：突变杂合子（N/+、0/N）中间型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子 （+/+、0/+）重型地贫：突变双重杂合子/突变纯合子 （0/0、0/+）中国人中国人HPFHHPFH和
4、和-地贫的基因突变类型及地贫的基因突变类型及表型特征表型特征 突变类型缺失长度(kb，缺失型)或受累基因(非缺失型)Hb F(%)G(%)其它种族缺失型G+(A)0-地贫中国型1009.321.283100广州型4319.495云南型909.316.77290GA-HPFH东南亚型29.70.514.127.05763越南、柬埔寨人A-HPFH-196(CT)A14.320.98195意大利人GA-地贫-29(AG)22.340世界地中海贫血的流行分布广西地中海贫血的流行分布853共共57895789例例224例例834例例790例例1033例例1349例例1559例例 Xiong,et al
5、.Clin Genet 2010广西地中海贫血的流行分布血红蛋白病血红蛋白病分分 组组阳性样本数阳性样本数%-地中海贫血地中海贫血88615.32 静止型携带者静止型携带者3636.27 -地中海贫血特征地中海贫血特征4988.6 Hb H Hb H 病病 250.43-地中海贫血地中海贫血3706.39 携带者携带者2874.96 复合复合-地中海贫血地中海贫血791.36 中间型地中海贫血中间型地中海贫血40.07-地中海贫血地中海贫血90.16 携带者携带者60.1 复合复合-地中海贫血地中海贫血30.05血红蛋白结构变异血红蛋白结构变异220.38 携带者携带者170.29 复合复合-
6、地中海贫血地中海贫血40.07 复合复合-地中海贫血地中海贫血10.02总总 计计128722.25引起珠蛋白表达降低的常见缺失突变类型分布 MC10kb0kb20kb 30kb 40kb10kb3HVRinterHVR53 2 1 2 1 THAI BRIT FIL MED SEA 4.2 3.7 2.7 SPAN HW 27.6 11.1 2.4BlackBelgianIndianMalaysian 2GermanTurkishItalianGantoneseYunnaneseChineseS.E.AsianTaiwanese 0kb 50kb 100kb 150kb G A LCR引起地
7、中海贫血常见的基因缺失突变类型分步12 种见于中国人群的 2/1珠蛋白基因点突变 CD31CD125 EXON I EXON II EXON IIIIVS IIVS II UTRUTR53CD13CD59 CD122 CD142 CD44CD49CD30 2 1Missense mutationMini deletion or insersionTermination mutationFrameshifthttp:/globin.cse.psu.eduCD78 CD74 CD118 启动子突变启动子突变异常剪接异常剪接起始密码突变起始密码突变移码突变移码突变无义突变无义突变3UTR突变突变EX
8、ON 1IVS 1 EXON 2EXON 3 IVS 2显性突变显性突变53 46 种见于中国南方人群的-珠蛋白基因点突变 http:/globin.cse.psu.edu中国南方人群最为常见的地贫类型二、地中海贫血的致病机制胎儿血红蛋白主要由两条胎儿血红蛋白主要由两条 珠蛋白链、两条珠蛋白链、两条 珠蛋白链组成，还含有珠蛋白链组成，还含有 链、链、链、链、链链组成组成成年人的血红蛋白由两条成年人的血红蛋白由两条 珠蛋白链和两条珠蛋白链和两条 珠蛋白链组成珠蛋白链组成血红蛋白血红蛋白红细胞红细胞 链链 链链血红素血红素铁铁 链链 链链二、地中海贫血的致病机制11p15.3珠蛋白基因簇16p13
9、.3珠蛋白基因簇HbA HSHS 40 40 2 2 1 1 2 2 HS 5 4 3 2 1 HS 5 4 3 2 1 G G A A 二、地中海贫血的致病机制人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律人体不同发育时期的珠蛋白生成变化规律二、地中海贫血的致病机制静态突变静态突变点突变点突变 片段突变片段突变 动态突变动态突变 碱基替换碱基替换移码突变移码突变串联重复的三核苷酸序列随着串联重复的三核苷酸序列随着世代的传递而拷贝数逐代累加世代的传递而拷贝数逐代累加 缺失缺失重复重复重排重排基因突变的分子机制基因突变的分子机制基因致病突变是地贫发生的分子基础基因致病突变是地贫发生的分子基础二、地中海贫血
10、的致病机制三、地中海贫血基因分析1、Gap-PCR 用于和等缺失型地贫的检测221111 22111 1 SEA3.74.2A AB BC CD DE EF FG G原理：普通的酶无法扩增出长距离的片段，通过设计出与缺失序列的两侧翼序原理：普通的酶无法扩增出长距离的片段，通过设计出与缺失序列的两侧翼序列互补的引物，当存在缺失时，由于肽链靠近从而扩增出片段。列互补的引物，当存在缺失时，由于肽链靠近从而扩增出片段。三、地中海贫血基因分析2、PCR-RDB 用于检测和点突变PCR膜条膜条杂交杂交显色显色三、地中海贫血基因分析地贫基因检测的策略：地贫：先检测常见缺失型，然后检测非缺失（点 突变），最后
11、是未知的缺失和突变位点。因为90%地贫为常见的三种缺失型 （-sea,-3.7,-4.2)。地贫：先检测点突变，然后检测少见的缺失型。大部分地贫都是点突变型。血红蛋白病的筛查及基因诊断的技术流程遗传咨询遗传咨询 产前地贫携带者筛查策略产前地贫携带者筛查策略同时正常同时正常产检对象（孕妇及其配偶）产检对象（孕妇及其配偶）地贫分子诊断地贫分子诊断 知情同意选择知情同意选择 胎儿产前基因诊断胎儿产前基因诊断血液五分类分析（关注血液五分类分析（关注MCV和和MCH）+血红蛋白电泳（血红蛋白电泳（Hb A2)双方某项指标双方某项指标均同时降低均同时降低一方正常，另一方一方正常，另一方的指标的指标降低降低
12、地贫全套检查地贫全套检查异常的一方做地贫全套检查异常的一方做地贫全套检查-地贫特征地贫特征-地贫特征地贫特征ID双方均为双方均为-地贫特征地贫特征一方为一方为-地贫特征，另一地贫特征，另一方为方为ID或或-地贫特征地贫特征+-单纯性单纯性ID或单或单纯性纯性-地贫地贫双方均为双方均为-地贫特征地贫特征ID或或-地贫特征的一方地贫特征的一方做做地贫分子诊断地贫分子诊断 夫妇双方基因诊断夫妇双方基因诊断血血R正常的正常的一方做一方做地地贫分子诊断贫分子诊断-单纯性单纯性ID或单或单纯性纯性-地贫地贫-+仅异常血红蛋白必要时测序或选择其中一种地贫检测四、最新的地中海贫血检测方法1、融链曲线分析法 用
13、于检测或缺失和点突变Thongperm,et al.Journal of Molecular Diagnostics.2010Xiong F,et al.J Mol Diagn.2011Christina V，et al.Clinical Chemistry.2003原理：根据每条肽链都有自己的Tm值，从而可以通过温度差来判断四、最新的地中海贫血检测方法2、MLPA（多重连接探针扩增）用于寻找未知缺失断裂点Xiao-Feng Wei，et al.Ann Hematol.2011四、最新的地中海贫血检测方法3、毛细管电泳 可以检测非缺失CS（Hb CS)和 E地贫Hb AHb EHb A2Can
14、 Liao,et al.European Journal of Haematology.2010 四、最新的地中海贫血检测方法4、DHPLC（变性高效液相色谱）用于缺失型和突变型地贫都可以李倩，南方医科大学论文，2010四、最新的地中海贫血检测方法5、基因序列测定（PCR+毛细管电泳）用于未知突变位点或确定缺失片段的位置 由于仪器比较贵重，技术要求高，目前尚未在临床一线 推广，只在科研实验室里开展。Azam Amirian MSc，et al.Archives of Iranian Medicine.2011四、最新的地中海贫血检测方法6、母体血浆中胎儿游离核酸的测定严提珍，国际输血及血液学杂
15、志，2009严提珍，国际输血及血液学杂志，2009五、检测结果分析及报告（一）地贫基因诊断1 1、-SEA SEA/2 2、/3 3、/4 4、-SEA SEA/-/-4.24.25 5、-SEA SEA/-/-4.24.26 6、-SEA SEA/-/-3.73.7 7 7、/8 8、-SEA SEA/9 9、DNA MarkerDNA Marker缺失型地贫电泳结果 1 2 3 4 5 6 7 8 9非缺失杂交结果非缺失杂交结果CS纯合WS杂合未检测到6种突变（注意不是正常）41-42N654N-28N71-72N17N EN31N27/28M41-42M654M-28M71-72M17M
16、 EM31MIVS-I-1M43M-32M-29M-30M14-15MCAPIntMIVS-I-5M 28/N IVS-II-654/N CD17/N CD4142/N 28/28CD17/IVS-II-654ABCDEF地中海贫血点突变分析结果血涂片染色（包涵体）Cornelis L H，Orphanet Journal of Rare Diseases，2010五、检测结果分析及报告（三）基因诊断报告单1、临床地贫基因报告 主要是常规试剂可以检测到的类型，一般都会包括被测样本的信息，检测方法，检测试剂，检测者的签名，诊断结果以及临床提示。2、临床科研报告 由于常规检测不到，但是患者又必须进一步检测确定的罕见或未知地贫类型。报告信息只包括被测样本信息，检测方法，检测试剂，诊断结果及临床提示，没有检测者的签名（不承担法律后果）。地贫基因分析诊断报告单（alpha 地贫）新修改的报告单珠蛋白基因缺失和发生的三联体基因座的分子机制珠蛋白基因缺失和发生的三联体基因座的分子机制
