1、第十四章第十四章基因重组与基因工程基因重组与基因工程基因重组基因重组：genomic recombination重组重组DNA：recombinant DNA第一节、自然界的基因重组第一节、自然界的基因重组 转化：转化：transformation 整合：整合：integration 转导：转导：transduction 转位：转位：transposition转化转化 转化转化：由外来由外来DNA引引起生物起生物类型改类型改变的过变的过程称为程称为转化。转化。细菌的转化细菌的转化转化转化 病毒癌基因病毒癌基因感染宿主细感染宿主细胞后，可整胞后，可整合到宿主染合到宿主染色体上，从色体上，从而使宿
2、主细而使宿主细胞癌变。胞癌变。转染：转染：噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体噬菌体感染宿主菌后，核酸进入菌体内的过程。内的过程。细胞的转化细胞的转化整合整合 整合：整合：噬菌体感染大肠杆菌的第一步噬菌体感染大肠杆菌的第一步 噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的噬菌体粘附于细胞壁上，将自身的 DNA注入菌体中。注入菌体中。此此 DNA可与细菌染可与细菌染色体重组，成为细菌染色体的一部分。色体重组，成为细菌染色体的一部分。溶原菌：溶原菌：整合了噬菌体基因组的细菌。整合了噬菌体基因组的细菌。裂解：裂解：噬菌体感染大肠杆菌的第二步噬菌体感染大肠杆菌的第二步 DNA利用菌体的酶系统，复制自身及利用菌体的酶系统，
3、复制自身及外壳蛋白，组装成大量新外壳蛋白，组装成大量新 噬菌体，并噬菌体，并将细菌涨破。将细菌涨破。整合整合 溶原溶原和和裂裂解解可可以相以相互转互转变。变。转导转导 溶原菌中溶原菌中 DNA可以原样地切离出来，可以原样地切离出来，也可以也可以把邻近的宿主把邻近的宿主DNA在切离时带走在切离时带走一部分。后者称一部分。后者称转导转导。带有宿主带有宿主DNA的噬菌体称的噬菌体称转导噬菌体转导噬菌体。来源于宿主的基因称来源于宿主的基因称转导基因转导基因。转位转位 转位转位：一个或一组基因从一处转到基因：一个或一组基因从一处转到基因组的另一个位置。组的另一个位置。这些游动的基因称为这些游动的基因称为
4、转位子转位子(transposon)。转位转位第二节、基因工程第二节、基因工程 基因工程基因工程：是用分离纯化或人工合成的：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体在体外与载体DNA结合，成为重组结合，成为重组DNA，用以转化宿主，筛选出能表达重，用以转化宿主，筛选出能表达重组组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为增，成为克隆克隆。也叫。也叫基因克隆基因克隆或或重组重组DNA技术技术。分子水平上操作，细胞水平上表达。分子水平上操作，细胞水平上表达。赋予重组赋予重组DNA以新的生命力。以新的生命力。基因工程基因工程肿瘤细胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，肿瘤细
5、胞的转移与细胞表面的糖链类型有关，而后者又与糖基转移酶的表达相关。而后者又与糖基转移酶的表达相关。已经证实已经证实GnT-与转移有关。与转移有关。转入转入GnT-基因基因肝癌细胞株肝癌细胞株SMMC7721观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为观察其迁移、侵袭、粘附等生物学行为转入反义转入反义GnT-基因基因转移转移 转移转移 基因克隆基因克隆分分切切接接转转筛筛载体和目的基因载体和目的基因 载体载体：vector 在宿主细胞内可独立复制的完整在宿主细胞内可独立复制的完整DNA分分子。但必须利用宿主的酶系统，才能有子。但必须利用宿主的酶系统，才能有进一步的基因表达能力。进一步的基因表达能力。常用的
6、载体有：常用的载体有：质粒、质粒、噬菌体噬菌体、M13 噬菌体噬菌体 逆转录病毒逆转录病毒DNA、昆虫病毒、昆虫病毒DNA 载体与宿主共培育可大量生成，经纯化载体与宿主共培育可大量生成，经纯化后可用于基因工程。后可用于基因工程。质粒质粒 质粒质粒：plasmid 环形双链环形双链DNA，大小约为数千碱基对，大小约为数千碱基对，存在于大多数细菌的胞质中。存在于大多数细菌的胞质中。拷贝数拷贝数：每个细菌能容纳的质粒数目。：每个细菌能容纳的质粒数目。质粒的性质：质粒的性质：易于从一个细菌转移入另一个细菌。易于从一个细菌转移入另一个细菌。有两三个抗药性基因。有两三个抗药性基因。有一个限制性内切酶切口。
7、有一个限制性内切酶切口。质粒质粒 pBR322：常用的常用的质粒质粒噬菌体载体噬菌体载体 噬菌体噬菌体、M13 噬菌体噬菌体 易于感染大肠杆菌易于感染大肠杆菌 噬菌体噬菌体DNA比质粒大，对限制性内切比质粒大，对限制性内切酶有不止一个切口，需经过改造。酶有不止一个切口，需经过改造。一个切口：插入型载体。一个切口：插入型载体。二个切口：置换型载体。二个切口：置换型载体。噬菌体载体噬菌体载体目的基因的来源目的基因的来源 直接从染色体直接从染色体DNA中分离：原核生物中分离：原核生物 人工合成：简单的多肽人工合成：简单的多肽 从从mRNA合成合成cDNA：真核生物：真核生物 基因文库：基因文库：(g
8、ene library）G文库：用基因组的全部文库：用基因组的全部DNA制备。制备。c文库：文库：用细胞的全部用细胞的全部mRNA制备出全套制备出全套cDNA后建库。后建库。从从mRNA合成合成cDNA限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用 限制性内切酶可辨认限制性内切酶可辨认46个核苷酸：回文结构个核苷酸：回文结构 回文结构回文结构：palindrome DNA双链具有方向相反顺序一致的结构。双链具有方向相反顺序一致的结构。平端：平端：blunt end 在同一水平上切断两条链。在同一水平上切断两条链。(钝型末端钝型末端)粘性末端：粘性末端：sticky end 碱基序列被酶以错开几个核苷酸的
9、形式切开。碱基序列被酶以错开几个核苷酸的形式切开。限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用 Alu I .AGCT.AG CT.平端平端 .TCGA.TC GA.BamH I GGATCC .G GATTC 粘性粘性 .CCTAGG CCTAAG G 末端末端 限制性内切酶的应用限制性内切酶的应用切载体切载体切目的基因切目的基因限制性限制性内切酶内切酶相同粘性末端相同粘性末端两者相连两者相连要点：避免切断目的基因要点：避免切断目的基因载体和目的基因的连接载体和目的基因的连接 人工连接器人工连接器：linker 人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内人工合成的寡核苷酸，安置有限制性内切酶的识别序列。切酶
10、的识别序列。DNA连接酶连接酶：可用于连接碱基互补的二：可用于连接碱基互补的二段核酸链。段核酸链。连接方式：连接方式：粘端连接方式粘端连接方式 尾接法尾接法粘端连接粘端连接尾接法尾接法重组体的转化重组体的转化 基因的转移：基因的转移：重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多重组体进入宿主细胞的过程，已开发了很多方法。方法。化学法：化学法：CaCl2转移法、碱金属离子转移法转移法、碱金属离子转移法 物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法物理法：显微注射法、基因枪法、电穿孔法 生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体生物学法：逆转录病毒载体、腺病毒载体重组体的转化重组体的转化 转化：重组载体导入宿主后，
11、利用宿主转化：重组载体导入宿主后，利用宿主的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的酶系统表达的过程。即改变宿主性状的过程。的过程。基因工程的表达体系的发展基因工程的表达体系的发展载体宿主第一代质粒、噬菌体细菌第二代穿梭质粒酵母第三代动 植 物 病 毒、昆虫载体组织培养细胞第四代DNA 直接导入生殖细胞DNA重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定 根据重组载体的表型进行筛选：根据重组载体的表型进行筛选：如质粒的抗药性、营养素的依赖型如质粒的抗药性、营养素的依赖型 DNA限制酶切图谱分析：限制酶切图谱分析：提取经粗选后的宿主提取经粗选后的宿主DNA，用限制性内，用限制性内切酶切割后与原来载体比较。切酶切
12、割后与原来载体比较。利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定：用目的基因作探针监测宿主用目的基因作探针监测宿主DNA是否重是否重组体。组体。DNA重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定 灭活法灭活法筛选重筛选重组体。组体。提取转化细胞提取转化细胞DNA限制性内切酶限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳与原来载体及重组体比较与原来载体及重组体比较DNA重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定DNA重组体的筛选与鉴定重组体的筛选与鉴定菌落菌落硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜探针探针X线底片线底片显影显影平板平板基因工程策略基因工程策略第三节、基因工程的应用第三节、基因工程的应用
13、生命科学研究趋势生命科学研究趋势 基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗 基因工程产品的开发和应用基因工程产品的开发和应用生命科学研究趋势生命科学研究趋势 基因的结构与功能研究基因的结构与功能研究 基因表达的调控基因表达的调控 各种生物大分子之间的识别及结合各种生物大分子之间的识别及结合 了解生命的奥秘了解生命的奥秘基因诊断和基因治疗基因诊断和基因治疗基因工程产品的开发和应用基因工程产品的开发和应用 基因工程疫苗：安全廉价基因工程疫苗：安全廉价 乙肝疫苗、甲肝疫苗乙肝疫苗、甲肝疫苗 巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、基因工程生产激素类：基因工程生产激素类：胰
14、岛素、生长激素胰岛素、生长激素 细胞因子：细胞因子：生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、生长因子、肿瘤坏死因子、造血因子、干扰素干扰素第五节、聚合酶链反应第五节、聚合酶链反应 聚合酶链反应：聚合酶链反应：PCR polymerase chain reaction 耐热细菌：耐热细菌：DNA聚合酶能耐高温，在聚合酶能耐高温，在7080有很高的催化力。有很高的催化力。原理：以目的原理：以目的DNA为模板，快速合成大为模板，快速合成大量的量的DNA，用于检测、制备、研究。，用于检测、制备、研究。第五节、聚合酶链反应第五节、聚合酶链反应 变性：变性：95、15s 引物粘合：引物粘合：55、30s 引物延伸：引物延伸：72、1.5m
