1、医学免疫学实验 实验三实验三 （一）免疫标记技术（一）免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法）、酶联免疫吸附试验（双抗体夹心法） 2、斑点免疫层析试验、斑点免疫层析试验 （二）免疫细胞的分离与纯化（二）免疫细胞的分离与纯化 1.密度梯度离心法分离外周血单个核细胞密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（含淋巴细胞）（含淋巴细胞） （三（三）免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定 1、E玫瑰花环试验（示教）玫瑰花环试验（示教） 2、淋巴细胞转化试验（示教）、淋巴细胞转化试验（示教） （四）结核病相关的免疫试验简介（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA） 待检标本待检标本 阳性对照阳性对照 阴性对照
2、阴性对照“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37，30分钟： （一）免疫标记技术（一）免疫标记技术【概念或原理概念或原理】： 利用荧光素、酶、胶体金、发光物质以及放射性核素等易显示物（标记物）连接于已知抗体或抗原，再去检测待测标本中的相应抗原或抗体的量或其存在与否。【分类分类】 荧光免疫技术 酶免疫技术ELISA（双抗体夹心法双抗体夹心法 ） 放射免疫技术 金免疫技术斑点免疫层析试验斑点免疫层析试验 化学发光免疫技术等 Ag Ab 荧光素荧光素AgAb荧光素荧光素 Ab 荧光素荧光素（？）（？） Ab荧光素荧光素（洗涤）免疫标记技术举例：（
3、细胞表面可见荧光）6 cells with fluorescencetubercle bacillus with fluorescence8酶免疫技术酶免疫组化技术：组织或细胞中抗原定位酶免疫测定(如ELISA)：测液体标本中抗原或抗体ELISA (酶联免疫吸附试验，enzyme-linked immunosorbent assay) sandwich ELISA to detect Ag indirect ELISA to detect Ab competitive ELISA to detect Ab or Ag 1 1）已知抗体包被）已知抗体包被 2 2）洗板）洗板 3 3）加待检抗原标
4、本）加待检抗原标本 4 4）洗板）洗板 5 5）加酶标记抗体）加酶标记抗体 6 6）洗板）洗板 7 7）加底物显色，测定）加底物显色，测定 (measure color) 10（显色）（显色） （不显色）（不显色）（定量）（定量）( no Ag ) ( Ag )polystyreneSandwich ELISA (to detect Ag, 双抗体夹心法，原理)（封闭的意义）（封闭的意义）（一）免疫标记技术免疫标记技术 1、酶联免疫吸附试验 (ELISA) -双抗体夹心法 请按照实验指导讲义方法进行操作，第5-9步； 第5、7步孵育时间由60min改为30min； 结果肉眼判断 第5步按下页P
5、PT的图加样，加6个孔，37，30分钟，（实验课开始时已做，接着做第6步，洗板）（一）1、酶联免疫吸附试验（ELISA） 待检标本待检标本 阳性对照阳性对照 阴性对照阴性对照“ELISA双抗体夹心法”，第5步，加待检标本、阳性对照、阴性对照各2孔，每孔100ul，37，30分钟：13( Indirect ELISA to detect Ab )14（一）（一）2、斑点免疫层析试验、斑点免疫层析试验(dot gold immunochromatographic assay，DICA)the rapid tests that you might use to detect pregnancy, o
6、r diagnose an infection quickly in a doctors office.16 B C T R A(Nitrocellulose membrane)金标抗体（免疫金复合物）（小鼠金标抗体（免疫金复合物）（小鼠IgG）（抗）（抗HCG）特异性抗原（特异性抗原（HCG，绒毛膜促性腺激素），绒毛膜促性腺激素）固相特异性抗体（抗固相特异性抗体（抗HCG）固相抗小鼠固相抗小鼠IgG抗体抗体 阳性：阳性：T区、区、 R（或（或C）区均出现红）区均出现红色线条（两条红线）；色线条（两条红线）； 阴性：阴性：T区不出现红色线条，仅区不出现红色线条，仅R（或（或C）区出现红色线条（
7、一条红）区出现红色线条（一条红线）。线）。1718 positive negative invalid（一）（一）2、斑点免疫层析试验、斑点免疫层析试验 请按照实验指导讲义方法进行操作，请按照实验指导讲义方法进行操作，并判断结果，并判断结果， （二）免疫细胞的分离与纯化 1. 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（含淋巴细胞）（二（二）1. 外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离 密度梯度离心法密度梯度离心法 原理原理 1）人外周血中红细胞、粒细胞密度1.092左右，单个核细胞为1.0751.090。根据各类血细胞比重的差异，分离得到单个核细胞。 2）外周血单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞
8、，可进一步分离得到淋巴细胞。 离心前 离心后抗凝血分离液血浆层单个核细胞层单个核细胞层分离液红细胞、粒细胞（白色云雾状，薄层）Main method:Anticoagulated blood are layered on the top of Ficoll (lymphocyte separation medium), horizontal centrifugation,Four layers: plasma, lymphocytes, Ficoll, granulocytes and red blood cells;(figure)Collect lymphocytes.23方法1. 每桌（
9、4人，2组）准备抗凝血1份（约4ml）；（已做，用前混匀）2. 将分层液（淋巴细胞分离液）加入试管（已做）3. 每组用吸管吸取肝素抗凝血约2ml缓慢加在淋巴细胞分离液之上（沿试管壁缓慢加入）；4. 水平离心(2000rpm, 20 min)；方法5. 将吸管轻插至淋巴细胞层，沿试管壁周缘轻轻吸取上下液界面间的单个核细胞层，置另一干净试管内；6. 洗涤单个核细胞2次(加入约1ml Hanks 液, 混匀，离心，1500或2000rpm，5min，倒去上清；重复1次)；7. 用残留上清(或加Hanks 液约0.1ml)重悬获得的单个核细胞，备用；8. 吸取单个核细胞混悬液，加一滴于载玻片上，显微镜
10、下观察单个核细胞（以淋巴细胞为主）Lymphocytes (淋巴细胞)Lymphocytes, cancer cells? 淋巴细胞（淋巴癌？） normal small lymphocyte in blood smear(血片中淋巴细胞血片中淋巴细胞) lymphocyte small lymphocytes (cancer cells) in non-Hodgkins lymphoma 小淋巴细胞（非霍奇金小淋巴细胞淋巴瘤） （三）免疫细胞功能测定 1、E花环试验 原理： T细胞表面有绵羊红细胞受体（E受体）(CD2)，若T细胞与绵羊红细胞共同孵育，T细胞周围吸附绵羊红细胞，为花环形成细胞
11、， 可用来鉴定和计数T细胞 T细胞 SRBC 花环形成细胞 B细胞 SRBC（6080）CD2 E 花环形成率= 形成E花环细胞数形成E花环细胞 + 未形成花环淋巴细胞100%(6080%) E 花环形成率= 形成E花环细胞数形成E花环细胞数 + 未形成花环细胞数100%总E花形成率：6080% 活性E花形成率：2540% rosette forming cellT cellrosette forming cellrosette forming cellsrosette forming cell (electron microscope) 显微镜下观察花环形成细胞，310室，不要求计算E花环形
12、成率。 （三）2、淋巴细胞转化试验 PHAT淋巴细胞 （小细胞） 淋巴母细胞 T cell lymphoblast (small cell) (large cell) B cell resting B cell (small cell)(Untransformed lymphocytes) (transformed lymphocytes) (转化的淋巴细胞)(未转化的淋巴细胞)PHAPHA 转化率 = 转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数 + 未转化的淋巴细胞数100% T cells T cells + B cells100%（6080%）核分裂相细胞过渡型细胞转化的淋巴细胞转化的淋巴细胞包括
13、以下三种细胞：（1）淋巴母细胞淋巴母细胞：体积明显增大，为成熟淋巴细胞的34倍。核膜清晰，核染色质疏松，呈细网状。核内见明显核仁14。胞浆丰富，嗜碱性，有伪足样突出。胞浆内有时可见小空泡。（2）过渡型淋巴细胞过渡型淋巴细胞：具有上述淋巴母细胞的某些特征。核质疏松，可见核仁，胞浆增多，嗜碱性强。体积比小淋巴细胞大。（3）核分裂相细胞核分裂相细胞：核呈有丝分裂，可见许多对成堆或散在的染色体。 Lymphoblast ( typical, morphological features): Lymphoblasts are 12-20 m in diameter with a round to ova
14、l nucleus, sometimes eccentric in location. The nucleus to cytoplasm ratio is about 4:1 and the periphery of both the nucleus and the cell may be irregular in outline. The fine, highly dispersed nuclear chromatin stains a light reddish-purple, and one or two pale blue or colorless large nucleoli are
15、 visible. The cytoplasm is usually agranular and deeply to moderately basophilic, with marginal (peripheral) intensity a common characteristic. (Small resting lymphocytes are 6-8 m in diameter)46 Small lymphocytes transformed lymphocytes (lymphoblasts, large cells) mitosis metaphase(Ag or mitogen)st
16、imulation untransformed lymphocyte, small transitional cell typical lymphoblast untransformed lymphocyteLymphoblast, (transformed lymphocyte)Acute lymphocytic leukemiaLymphoblast, 原始淋巴细胞Lymphoblast, 原始淋巴细胞核仁核仁图1 狗外周血中的淋巴母细胞图2（大图）、狗急性淋巴细胞性白血病血片，可见大量淋巴母细胞。图3（小图）、外周血涂片，成熟小淋巴细胞mature lymphocytes, small
17、celllymphocyte 显微镜下观察典型淋巴母细胞，不要求计算淋巴细胞转化率。（四）结核病相关的免疫试验(免疫学检测技术在疾病诊断中的应用举例) 1. 肺结核诊断需要做哪些检查： （1）结核菌检查：痰中找到结核菌是确诊肺结核的主要依据。镜检（抗酸染色，荧光染色）；培养法（传统或Bactec法等）；PCR法查痰；其他（ELISA）（2）影像学检查：胸部X线检查不但可早期发现肺结核，而且可对病灶作出判断，对决定治疗方案很有帮助。胸部CT检查对于发现微小或隐蔽性病变，了解病变范围及组成，对于诊断是有帮助的。（3）结核菌素（简称结素）试验： IV型超敏反应；阳性表明机体受到（或曾经）结核菌感染或
18、接种过卡介苗，也表示机体对结核菌有一定免疫力 （4）其他检查：血沉，CRP(免疫比浊法)等，在评价肺结核病情活动性有一定的价值。 2. 肺结核检查中免疫相关实验： （1）结核菌检查： 荧光染色镜检找结核菌；结核菌： （2）结核菌素（简称结素）试验 用于诊断结核菌感染的皮肤试验。为IV型超敏反应，迟发型超敏反应： 原理：抗原(结核菌或卡介苗)进入机体使机体的免疫T淋巴细胞致敏，并大量分化增殖。当已致敏的机体再次遭受到抗原入侵时，致敏淋巴细胞就会与之结合，引起变态反应性炎症。表现在结核菌素注射部位形成硬结甚至发生水泡、坏死。 阳性表明机体受到或曾经受到结核菌感染或接种过卡介苗；阴性可能免疫力低下或
19、卡介苗接种失败或未感染过结核菌，也可能技术原因而呈现假阴性；阴性大多可除外结核感染。 结核菌素（结素）试验类型OT试验：前臂皮内注射OT，5IU。旧结素（old tuberculin，OT）是从生长过结核菌的液体培养基中提炼出来的结核菌代谢产物，主要含有结核蛋白。注射后分别于24、48、72小时观察反应一次（以72小时的结果为准）。局部硬结小于5mm为阴性，59mm为弱阳性，1019mm为阳性反应，20mm以上或局部发生水泡与坏死者为强阳性反应。PPD试验：前臂皮内注射PPD，5IU。结素的纯蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）为纯结素，不产生非特异性反
20、应。硬结平均直径5mm为阳性反应。 阳性的意义：阳性的意义：阳性表示曾感染结核,不一定现在患病.1.一般阳性和中度阳性：结核病现症患者.已受结核菌感染但并不意味着发病或患病.卡介苗接种所致变态反应.3岁内未接种卡介苗者提示体内存在结核病灶, 应及时进行结核菌检查,影像学检查,血沉等检查以确定诊断和治疗.2.强阳性：（1）结核病患者.（2）感染结核菌未发病者.强阳性人群结核病的发病率高,在未找到病变时可作预防性治疗.3.如果2年内PPD试验结果由阴性（-）转为阳性（+）,或反应强度从原来硬结直径10mm,提示新近感染过结核菌,或可能存在活动性病灶. 4.如用高稀释度（1IU）作皮试呈强阳性者，常
21、提示体内有活动性结核灶。 阴性的意义：阴性的意义：表示未受结核菌感染.（未受感染或曾受感染但时间已久，反应消失者）婴幼儿PPD试验阴性应该及时接种卡介苗. 免疫力低下（如免疫缺陷病）某些情况下不排除已受结核菌感染,如变态反应前期;患急性传染病,发热,使用免疫抑制剂等;免疫功能低下如重症结核病,慢性消耗性疾病,肿瘤,艾滋病,高龄等.阴性也不表示没有结核感染.值得注意的是假阴性情况,在临床上有感染结核的确切依据而患者PPD试验却阴性,这种情况常见于以下疾病：初次感染结核菌48周以内,重度营养不良,恶性肿瘤,机体免疫缺陷性疾病（先天性免疫缺陷症,艾滋病）,免疫抑制剂使用者等,个别老年人因机体变态反应功能低下也常呈阴性反应.
