1、Instrumental Analysis1荧光分析法荧光分析法Instrumental Analysis2荧光分析法荧光分析法第三版第三版 许金钩、王尊本主编，科学出版社许金钩、王尊本主编，科学出版社参考书参考书 Instrumental AnalysisInstrumental AnalysisInstrumental Analysis5 * * 分子能级分子能级比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多比原子能级复杂，分子所具有的能级数目远多于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转于原子能级数目。在每个分子的电子能级上，都存在振动、转动能级；动能级； * * 基态基态激发态激
2、发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁一次到位；次到位； * * 激发态激发态基态基态：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快：弛豫过程，多种途径和方式；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；、激发态寿命最短的途径占优势； 1. 1. 分子能级与跃迁分子能级与跃迁Instrumental Analysis6* * 大多数有机分子的大多数有机分子的基态基态处于单重态；处于单重态；* * 电子电子激发态激发态有有单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向单重态与三重态之分（取决于电子的自旋方向 M=2S+1，S为电子自旋量子数的代数和为电子自旋量子数的代数和(0或或1)
3、；* * 根据洪特规则，平行自旋（根据洪特规则，平行自旋（三重态三重态）比成对自旋（）比成对自旋（单重态单重态） 稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低；稳定，因此，三重态能级比相应单重态能级低； S0T1 属于禁阻属于禁阻跃迁，需要通过其跃迁，需要通过其他途径进入，而且他途径进入，而且进入的几率小；进入的几率小； Instrumental Analysis7 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。和无辐射跃迁等方式失去能量。传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光磷光磷光内转换内转换外
4、转换外转换系间窜越系间窜越振动弛豫振动弛豫无辐射跃迁无辐射跃迁S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间窜跃内转换振动弛豫能量l l 2l l 1l l 3 外转换l l 2T2内转换振动弛豫Instrumental Analysis9 振动弛豫振动弛豫：同一：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s。 内转换内转换：同多重态电子能级中：同多重态电子能级中,不同能级间的无辐射能级交换不同能级间的无辐射能级交换 通过内转换和振动弛豫，高激发
5、单重态的电子跃回第一激通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激发单重态的最低振动能级。发单重态的最低振动能级。 外转换外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；移能量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。系间窜跃系间窜跃：不同多重态：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。有重叠的转动能级间的非辐射跃迁。Instrumental Analysis10 S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间窜跃系间窜跃振动弛豫振动弛豫 T1 S0磷光发射磷光发射：电子由第一激
6、发电子由第一激发三重态三重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态 （ T1 S0跃迁跃迁）；）；电子由电子由S0进入进入T1的可能过程：的可能过程：发光速度很慢：发光速度很慢： 10-410 s ，即光照停止后，可持，即光照停止后，可持续一段时间。续一段时间。荧光发射荧光发射：第一激发第一激发单重态单重态的最低振动能级的最低振动能级基态基态 （ S1 S0跃迁跃迁） 10-710 -9s（ S0 T1禁阻跃迁）禁阻跃迁）Instrumental Analysis11Instrumental Analysis12发射荧光的分子数激发分子的总数 荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有荧光量
7、子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；1FnFiikFkk k kF F主要取决于化学结构，而主要取决于化学结构，而S Sk ki i则主要取决于则主要取决于化学环境，同时也与结构有关。化学环境，同时也与结构有关。大多数荧光物质的量子产率在大多数荧光物质的量子产率在0.11之间。之间。Instrumental Analysis13（1）跃迁类型跃迁类型： * 的荧光效率高。这是因为的荧光效率高。这是因为 * 跃跃迁的摩尔吸收系数比迁的摩尔吸收系数比 n *大，且大，且 *跃迁的寿命比跃迁的寿命比n *要短。要短。
8、（2）共轭效应共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移。移。（3）刚性平面结构刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。酚酞却没有。（4）取代基效应取代基效应：芳环上有：芳环上有供电基，使荧光增强。重原子供电基，使荧光增强。重原子效应。效应。Instrumental Analysis14Instrumental Analysis15小结：小结：Instrumen
9、tal Analysis16 1.荧光强度和溶液浓度的关系荧光强度和溶液浓度的关系 荧光强度荧光强度 If正比于体系吸收的激发光的光强，即正比于体系吸收的激发光的光强，即 ： If = K( I0 - I ) 由朗由朗-比耳定律：比耳定律： I / I0= 10- b c代入代入，得：，得： If = KI0(1-10- b c )将此式展开，即将此式展开，即 低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓低浓度时，荧光强度与物质的浓度呈线性关系，高浓度时，由于自吸收和自熄灭等原因，线性关系不成立。度时，由于自吸收和自熄灭等原因，线性关系不成立。023(2.3)(2.3)2!3! 2.3Fbc
10、bcIK Ibc 浓度很低时，浓度很低时， bc 0.05，则可近似写成：，则可近似写成： If = 2.3 I0 l c = Kc 定量分析的基础定量分析的基础Instrumental Analysis172.2.溶剂的影响溶剂的影响 溶剂的介电常数越大，荧光峰的波长越长，荧光效率越大；溶剂的介电常数越大，荧光峰的波长越长，荧光效率越大； 含有重原子的溶剂（碘乙烷）中，由于重原子效应，使荧光含有重原子的溶剂（碘乙烷）中，由于重原子效应，使荧光减弱；减弱； 溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生溶剂的极性、氢键、配位键的形成都将使化合物的荧光发生变化。变化。3.3.温度的影响温度
11、的影响 荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加增加,从而导致荧光强度的下降。从而导致荧光强度的下降。 影响荧光强度的影响荧光强度的外部因素外部因素Instrumental Analysis184. 溶液溶液pH 对酸碱化合物，溶液对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；的影响较大，需要严格控制；OH-H+O-OHO-OH-H+有荧光有荧光无荧光无荧光无荧光无荧光有荧光有荧光NH3OHHNH2NHOHHpH13 无荧光Instrumental Analysis19 自吸现象自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其：化合
12、物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收。吸收光谱的长波长端重叠，产生自吸收。碰撞猝灭碰撞猝灭 是荧光熄灭的主要原因。是荧光熄灭的主要原因。5.5.荧光的熄灭荧光的熄灭 氧的熄灭作用等。氧的熄灭作用等。浓度越大、温度越高，碰撞机会越大浓度越大、温度越高，碰撞机会越大粘度越大，碰撞机会越小粘度越大，碰撞机会越小Instrumental Analysis20 测量荧光的仪器主要由测量荧光的仪器主要由五个部分五个部分组成：激发光源、样品组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器、记录装置。池、双单色器系统、检测器、记录装置。 特点特点：（与（与UV-UV-visvis仪器的
13、比较）仪器的比较）有两个单色器，光源与检测有两个单色器，光源与检测器通常成直角。器通常成直角。两个单色器分别是：两个单色器分别是：1 1）选择激发光波长的第一）选择激发光波长的第一单色器单色器2 2）选择发射光）选择发射光( (测量测量) )波长波长的第二单色器的第二单色器Instrumental Analysis21Instrumental Analysis22检测器检测器：光电倍增管。光电倍增管。样品池样品池：材料：与材料：与UV-vis吸收池吸收池 相同。相同。形状：形状：？光源光源：氙灯和高压汞灯，染料激光器氙灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区可见与紫外区)氙灯：连续光源，发射光束
14、强度大。波长范围：氙灯：连续光源，发射光束强度大。波长范围：200700nm, 在在200400nm波段内，光谱强度几乎相等。波段内，光谱强度几乎相等。Instrumental Analysis23Instrumental Analysis24If ex (固定 em)光光源源第一第一单色单色器器第二第二单色单色器器激发激发荧荧光光样品样品池池检测系检测系统统1.荧光的激发光谱曲线荧光的激发光谱曲线2.荧光的发射光谱曲线荧光的发射光谱曲线（荧光光谱）（荧光光谱）If em (固定 ex)Instrumental Analysis25粗步设定ex，扫描 em萘的激发、荧光光谱萘的激发、荧光光谱e
15、xem相对强度相对强度固定em（最佳），扫描ex固定ex（最佳），扫描 em荧光（发射）光谱曲线II荧光激发光谱曲线 II荧光（发射）光谱曲线 IIIIIIIIInstrumental Analysis26 (1) Stokes(1) Stokes位移位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比发射光谱的波长比激发光谱的长，激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。振动弛豫消耗了能量。 (2) 发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生产生不同吸收带
16、，不同吸收带，但均回到但均回到第一激发单重态的最低振动能级第一激发单重态的最低振动能级再跃再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。迁回到基态，产生波长一定的荧光。 Instrumental Analysis27瑞利散色和拉曼散色瑞利散色和拉曼散色Instrumental Analysis281. 1. 特点特点（1 1）结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、 光强、荧光量子效率、荧光寿命等。光强、荧光量子效率、荧光寿命等。（2 2）选择性强）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（3 3）试样
17、量少，应用范围广）试样量少，应用范围广。（4 4）灵敏度高）灵敏度高 分析物浓度范围：分析物浓度范围：1010-5-5 1010-8 -8 mol/Lmol/L，检测下限：，检测下限：0.10.10.10.1 g/cmg/cm-3-3 比紫外比紫外- -可见分光光度法高可见分光光度法高2 24 4个数量级。个数量级。 Instrumental Analysis29(1)(1)定性方法定性方法 任何荧光都具有两种特征光谱：激发光谱与发射光谱。它们是荧光定性分析的基础。(2)(2)定量定量方法方法 If = 2.3 I0 b c = KcInstrumental Analysis30(1)(1)无
18、机、有机化合物的分析无机、有机化合物的分析 在紫外光照射下能产生荧光的无机物极少，难以利用其自身的荧光在紫外光照射下能产生荧光的无机物极少，难以利用其自身的荧光来进行测定。来进行测定。 通常采用与有机试剂形成配合物后测量，通常采用与有机试剂形成配合物后测量，或通过其对荧光试剂的荧光增强或猝灭效应进行测定。目前可测量元素或通过其对荧光试剂的荧光增强或猝灭效应进行测定。目前可测量元素已有约已有约6060多种。多种。无机化合物无机化合物（荧光）试剂（荧光）试剂荧光增强法荧光增强法荧光猝灭法荧光猝灭法Instrumental Analysis31Instrumental Analysis32 但在碱性
19、溶液经光线照射发生分解作用或在酸性但在碱性溶液经光线照射发生分解作用或在酸性KMnO4KMnO4氧化下都会生成荧光强度比维生素氧化下都会生成荧光强度比维生素B B2 2强得多的黄光素，并可强得多的黄光素，并可溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。溶于氯仿。利用此性质可提高测定的灵敏度和选择性。尿液中维生素尿液中维生素B2的测定的测定 维生素维生素B B2 2（核黄素）在（核黄素）在430 - 440 nm 430 - 440 nm 蓝光照射下会发蓝光照射下会发出绿色荧光，出绿色荧光，emem为为535 nm535 nm。它在。它在pH 6-7 pH 6-7 的溶液中荧光强的溶液中荧光
20、强度最大，而在度最大，而在pH 11pH 11时荧光消失；时荧光消失；Instrumental Analysis33Instrumental Analysis34Instrumental Analysis35(2)生物、医学研究生物、医学研究Instrumental Analysis36Instrumental Analysis37Instrumental Analysis38Instrumental Analysis39Instrumental Analysis40Instrumental Analysis41Instrumental Analysis42GFP是一种在395nm的激发光下可
21、以释放出绿色荧光的蛋白，现已广泛的应用于生物以及医学研究。该蛋白可以表达在真核细胞中，在和其他基因融合表达的情况下，可以活体示踪目的蛋白的定位以及活动.通过跟踪发出的绿光来观察病毒在宿主体内的扩散途径；或者把GFP接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动 从水晶水母体内第一次分离出荧光基因日裔科学家下村修1962年首先在水母中发现GFPMartin Chalfie(沙尔菲)指出GFP的发光特性在生物示踪方面有极高价值；商业用途：荧光鱼 改造后的GFP可发射其它颜色的荧光，允许科学家一次性跟踪一种以上的蛋白质。图片中美丽的“彩虹”就是大脑中的神经系统网络。华裔科学家华裔科学家钱永健钱永健改造了改造了GFP，使，使得它可以在不同的激发光下发红蓝得它可以在不同的激发光下发红蓝等各色，并且更加易于使用，大大等各色，并且更加易于使用，大大扩展了此类蛋白的应用。扩展了此类蛋白的应用。Instrumental Analysis45Instrumental Analysis46www. probes. comwww. probes. com
