1、柑桔组织培养研究柑桔组织培养研究山东亚龙生物科技有限公司 柑桔是芸香科柑桔属植物，其种类繁多，在全球热带、亚热带地区广泛种植。柑桔营养丰富，形色味俱佳，是人们喜爱的水果之一，具有极高的经济价值。改革开放以来，我国柑桔种植面积逐年扩大，但病原体病害一直困扰着柑桔生产，特别柑桔黄龙病、溃疡病尤为严重。通过组织培养的方法，开展无病原体苗培育，建立柑桔无性系快速繁殖技术，利用组织培养法开展品种改良和新品种培育是解决这些问题的重要途径。黄龙病溃疡病柑桔组织培养技术柑桔组织培养的应用柑桔组织培养存在问题与展望柑桔组织培养技术柑桔组织培养技术 在柑桔类果树中，由于营养系材料存在脱分化、再分化较困难，很难再生
2、出植株。因此,柑桔组织培养法主要通过胚珠、珠心等胚性细胞进行培养。下面根据外植体的类型分别予以讨论：离体珠心培养 离体胚珠培养 其它外植体的离体培养离体珠心培养离体珠心培养优点：方法简便易行缺点：约有26%的变异 珠心胚实生苗会具有各种童期性状，如多刺和结果晚 多数品种往往需要10a以上才能结果，这极大地影响了它在实践中的应用离体胚珠培养离体胚珠培养 利用柑桔的多胚性培育珠心苗，是柑桔组织培养中一种最早使用的方法。对于许多像脐橙这样的优良无核柑桔品种，由于大孢子母细胞常常退化，花粉完全败育。因此很难获得种子，所以只能在其败育之前通过离体胚珠培养加以解决。高峰利用“华盛顿脐橙”未受精胚珠,通过体
3、细胞胚胎发生或器官发生途径再生出完整植株,是国内首次报道利用胚珠离体培养获得的柑桔无病苗。谭祖国等以花后7周朋娜和纽贺尔脐橙的幼果为实验材料,挑取胚珠进行离体培养。结果发现在MT培养基上分别附加麦芽汁诱导愈伤组织及胚状体,胚状体及愈伤组织在附加NAA+BA培养基上,能较好地诱导多丛芽,在培养基中加入AgNO3(5mg/L)多次继代培养,能筛选出胚性愈伤组织。其它外植体的离体培养其它外植体的离体培养 在柑桔组织培养中单独用茎、叶片作为外植体的报道较少。林荣等对金桔叶片进行了愈伤组织的培养进行了研究之后偶有用柑桔叶片作为外植体进行培养,但诱导愈伤组织的频率不高。曾志云以南丰蜜桔的实生苗的茎段、子叶
4、节、上胚轴和下胚轴为外植体开展离体培养研究,将诱导出的芽转入MT+6-BA0.5+NAA0.1增殖培养基中进行培养,增殖系数可达8.8。培养基有利于南丰蜜桔不定根的诱导,生根率可达65.5%.经过几十年的研究，组织培养技术已成为柑桔业发展的一项重要技术，在苗木的快速繁殖、无病原体苗木的培育、种质资源的保存、柑桔育种等方面发挥了积极的作用。柑桔组织培养的应用柑桔无病原体苗的培育柑桔无病原体苗的培育 柑桔是感染病 原体病害最为严重的果树之一。病原体病害能使柑桔植株长势减弱、产量降低、品质变劣，严重威胁柑桔类的生产。由于病原体主要通过无性繁殖传染，因此建立无病原体的工厂化育苗、供应无毒接穗和苗木是消
5、灭柑桔病原体病的主要途径。柑桔无病原体苗的培育柑桔无病原体苗的培育 采取茎尖微嫁接方法是目前柑桔脱毒较为有效的方法。西班牙最早应用这种方法生产无病毒的柑桔母本树，并大量推广无病毒接穗，以防治柑桔速衰病、鳞皮病、裂皮病、青果病等病原体。无性系快速繁殖的工业化及试管苗品种的商业化，是柑桔组织培养的重要应用方向之一。用组织培养法作为良种快速繁殖的手段，主要有茎芽培养、愈伤组织培养、胚状体培养等三种类型。无性系的快速繁苗无性系的快速繁苗 组织培养技术在柑桔的杂交育种、突变育种及倍性育种方面具有重要的应用价值。杂交育种采用离体培养合子胚能够保证合子胚继续发育。突变育种采用组织培养技术并结合人工诱变的方法
6、来扩大突变范围倍性育种多倍性育种是培育柑桔无核品种的重要途径组织培养在柑桔育种中的应用组织培养在柑桔育种中的应用柑桔组织培养存在问题与展望柑桔组织培养存在问题与展望1、柑桔组织培养过程中增殖速度较慢2、快繁技术未过关3、长期离体条件下细胞易发生变异,利用胚心、胚珠培养都很难保证与母株遗传性状完全一致，遗传性状变化大，造成种苗不纯4、柑桔组织培养产生的珠心植物呈现多刺、开花晚等不利的童期特征5、柑桔遗传转化方面缺乏有应用价值的外源基因 因此,在应从优化培养条件和改善培养方法、诱导和驯化组培苗下地，构建优良外源基因用于转化等实验方面进行进一步研究。国内成功实现柑橘组培规模化生产的报道较少。我们以国
7、内成功实现柑橘组培规模化生产的报道较少。我们以樱桃组培为例，樱桃的种子萌发率低樱桃组培为例，樱桃的种子萌发率低,实生苗易感染病毒实生苗易感染病毒,扦插扦插繁殖系数低繁殖系数低,因而在生产实践的应用中受到很大的限制。采用因而在生产实践的应用中受到很大的限制。采用茎尖、茎段外植体进行樱桃快速繁殖茎尖、茎段外植体进行樱桃快速繁殖,可以提高优良品种的繁可以提高优良品种的繁殖系数和抗病能力殖系数和抗病能力,培育优良砧木培育优良砧木,改善嫁接亲和力。改善嫁接亲和力。展望展望 研究表明,欧洲大樱桃的组织培养与快速繁殖以3、4月中旬的新生幼嫩枝条为茎段外植体材料,接种诱导成功率最高。在建立樱桃茎段再生体系的过
8、程中,随着6-BA浓度的提高,芽分化率不断提高,但是苗分化相对细弱;而随着IAA浓度的提高,苗的生长量增加,苗较为茁壮。因此,只有在62-BA和IAA 2种激素浓度配比适宜的条件下,樱桃组培快繁才会获得较好的效果。研究表明,在附加6-BA1.5mg/L、IAA 0.3mg/L的MS培养基上茎段外植体生长健壮,芽分化数和诱导率较高,该培养基为茎段初代培养的最适培养基。温度对茎段组织培养再生不定芽也有一定的影响。经低温15处理的外植体更有利于芽分化。温度过高,顶芽褐死,产 生灼苗的现象;温度过低,植株生长停滞,不利于芽分化。所以,低温15处理3d后,转入正常温度25培养,茎段外植体芽分化率达到最高
9、。在继代培养中,6-BA浓度降低有利于提高腋芽增殖。在诱导芽分化时可能需要高浓度的细胞分裂素打破顶端优势,而继代培养时内源激素的持续积累导致内源激素浓度升高,所以在继代培养时应降低细胞分裂素的浓度。现有的影响木本植物组织培养的有关因子的研究也可借鉴到柑桔的组培实验中。1.1 培养基成分(1)基本培养基。在器官组织培养中,一般采用固体培养,而在细胞和原生质体培养中,则采用液体培养基。培养基中的盐浓度对外植体褐变和试管苗玻璃化均有一定影响。对某些植物来说,初代培养时培养基中无机盐浓度过高可引起酚类外溢物质的大量产生,导致外植体褐变,降低盐浓度则可以减少酚类外溢,从而减轻褐变。此外,培养基中的某些离
10、子会增加酚类合成与氧化酶的活性,降低盐浓度则可起到一定的抑制作用。对于玻璃化的试管苗来说,提高培养基中Ca2+的浓度,增加培养基中Mg、Mn、K、P、Fe、Cu元素含量,降低N和Cl元素比例,特别是降低铵态氮浓度,可降低玻璃化。(2)生长调节物质。在组织培养过程中,激素的种类及浓度对培养结果有重要影响。在以杨树为材料的试验中发现,愈伤组织在芽分化阶段如果不降低生长素浓度,则很容易永远失去分化能力。而植物的生根多数都是用生长素单独实现的,IBA有较好促进生根的作用。用幼年状态的材料在低浓度生 长素的培养基中一步生根,生根效果明显优于含有高浓度生长素的培养基;当他尝试用不含生长素的培养基一步生根时
11、,仍观察到幼年状态的材料有一定生根效果。这说明生长素完成诱导作用后,它们在培养基中存在对新根发生有抑制作用。因此,对木本植物的生根培养采用两步法:即先在富含生长素的培养基上进行根的诱导,尔后转接到无任何生长调节物质的培养基上进行根的伸长生长。这样不仅可提高生根率和有效根的数目,而且可限制芽苗基部愈伤组织的生成。(3)碳源。糖的使用浓度多在2%3%,但不同植物材料对糖类的反应不完全相同。杨树培养基中糖的使用浓度若超过3%,则易使愈伤组织变黑老化;另一方面,糖浓度太低也不宜于愈伤组织的诱导和分化。对于已发生玻璃化的试管苗来说,适当提高培养基中蔗糖含量,降低培养基中的渗透势,可以降低玻璃化。(4)琼
12、脂。在固体培养时,琼脂的使用浓度常为0.6%0.8%。邓成木认为应尽可能地降低琼脂的浓度,因为较软的培养基能诱导愈伤组织较好地发育,而太硬的培养基往往会使培养物不能与培养基紧密接触,不能很好地吸收养分而变黄。但孔祥生等在柿树组培试验中发现,琼脂含量低则试管苗水势高,玻璃化现象严重。把琼脂含量从0.6%提高到1.0%后,不仅能有效防止玻璃化现象的发生,而且提高了外植体的增殖倍数。(5)培养基的pH值。培养基的pH值因培养材料不同而异,大多数木本植物要求pH值在5.06.0。适当降低培养基pH值可以降低多酚氧化酶的活性和底物利用率,从而抑制褐变。培养基的pH值还可以通过影响培养物的营养元素的吸收过
13、程来影响呼吸代谢、多胺代谢与脱氧核糖核酸合成、植物激素进出细胞等作用,进而直接或间接地影响愈伤组织形成及形态建成。(6)活性炭。活性炭(AC)不是组织培养中的必需成分,但现有资料显示,活性炭在许多木本植物的组织培养中起着重要作用。赖家业在土柠檬、韩文璞在甜樱桃的组织培养中分别发现活性炭能明显地促进芽和根的生长。但由于活性炭具有较强的吸附能力,它能使培养基内有效物质的浓度降低,从而限制某些植物的生长。刘用生在胡杨的培养基中加入活性炭后芽丛不再增殖,甚至2周后芽开始萎黄。AC对外植体褐变有一定的抑制作用。活性炭除了能吸附培养基中的酚类物质、减轻对培养物的毒害外,还在一定程度上降低光照强度,从两方面
14、减轻褐变。李师翁等在沙棘组织培养中,加入活性炭有减轻褐化的作用,但同时也抑制了愈伤组织和芽的生长。刘用生研究活性炭吸附作用的结果表明:每mg的AC大约能吸附100g左右的生长调节物质,通常,AC的使用浓度在0.02%1%之间。在苹果富士品种的组培苗生根试验中发现,一般要经过继代培养7代以上,生根率才得以改进。此外,培养基中的某些离子会增加酚类合成与氧化酶的活性,降低盐浓度则可起到一定的抑制作用。在建立樱桃茎段再生体系的过程中,随着6-BA浓度的提高,芽分化率不断提高,但是苗分化相对细弱;而随着IAA浓度的提高,苗的生长量增加,苗较为茁壮。在柑桔类果树中，由于营养系材料存在脱分化、再分化较困难，
15、很难再生出植株。赖家业在土柠檬、韩文璞在甜樱桃的组织培养中分别发现活性炭能明显地促进芽和根的生长。下面根据外植体的类型分别予以讨论：刘用生研究活性炭吸附作用的结果表明:每mg的AC大约能吸附100g左右的生长调节物质,通常,AC的使用浓度在0.因此,对木本植物的生根培养采用两步法:即先在富含生长素的培养基上进行根的诱导,尔后转接到无任何生长调节物质的培养基上进行根的伸长生长。而植物的生根多数都是用生长素单独实现的,IBA有较好促进生根的作用。光照过强,可使多酚氧化酶的活性提高,从而加速被培养组织的褐变。病原体病害能使柑桔植株长势减弱、产量降低、品质变劣，严重威胁柑桔类的生产。邓成木认为应尽可能
16、地降低琼脂的浓度,因为较软的培养基能诱导愈伤组织较好地发育,而太硬的培养基往往会使培养物不能与培养基紧密接触,不能很好地吸收养分而变黄。在柑桔组织培养中单独用茎、叶片作为外植体的报道较少。3mg/L的MS培养基上茎段外植体生长健壮,芽分化数和诱导率较高,该培养基为茎段初代培养的最适培养基。3、长期离体条件下细胞易发生变异,利用胚心、胚珠培养都很难保证与母株遗传性状完全一致，遗传性状变化大，造成种苗不纯高峰利用“华盛顿脐橙”未受精胚珠,通过体细胞胚胎发生或器官发生途径再生出完整植株,是国内首次报道利用胚珠离体培养获得的柑桔无病苗。1.2 外植体的选择外植体的选择和处理对褐变有较大影响。Cheve
17、r分析欧洲栗的酚类含量的变化结果表明,幼龄材料酚类化合物含量少,而成龄材料比较多。王续衍对24个苹果品种进行茎尖培养时发现,以冬春季取材褐变死亡率最低,其他季节取材则都不同程度加重。此外,外植体组织受伤害程度直接影响褐变,在切取外植体时,伤口面积越小,表面消毒剂对外植体伤害越少,褐变越轻。1.3 培养条件(1)光照。光照对木本植物的外植体褐变和试管苗玻璃化有一定影响。光照过强,可使多酚氧化酶的活性提高,从而加速被培养组织的褐变。但增加光照,可促进试管苗成熟,加快幼茎木质化,从而降低玻璃化。光照还影响一些木本植物的生根。研究发现,对Calita李的生根培养,两周的黑暗处理对获得最大生根率是不可缺
18、的,光照则抑制根的形成。(2)温度。低温可以抑制酚类化合物的合成,降低多酚氧化酶的活性,从而减轻褐变,Wang等在苹果和桃的茎尖培养中发现,5的低温对控制褐变效果十分显著,而且在低温下培养时间越长,褐变越少,但存活率也随之下降,最佳时间为7天左右。温度对试管苗玻璃化有一定影响，在1026范围内培养的牡丹植株无玻璃苗出现,在2630范围内培养,有63%的试管苗发生玻璃化现象,而在30以上培养的牡丹苗竟有84%发生玻璃化现象。温度对生根也有一定影响。苹果无根苗在28生根最佳,而在21和23生根率下降,在22、25或29对生根无反应。木瓜无根苗,在日温和夜温相对保持在271和251时,生根最佳,若日温降低,根发生速率也降低。日温从221增到291时,根重随之增加,在29日温下,根变细,侧根增多。(3)继代培养次数。组培苗的继代次数对生根有一定影响。处于成年期的组培苗生根困难,而处于幼年期状态的和经过多代培养从成年期状态回转到童年期状态的组培苗,生根要容易得多。在苹果富士品种的组培苗生根试验中发现,一般要经过继代培养7代以上,生根率才得以改进。继代培养次数对外植体褐变和试管苗玻璃化也有一定影响。李师翁等在沙棘嫩茎的愈伤组织 培养中,及时转移培养材料,继代周期不超过4周,可有效降低愈伤组织的褐变。但继代次数也不可过多,继代4次或5次,则玻璃化频率提高,一般以23次最佳。
