1、 临临 床床 微微 生生 物物 学学 概概 论论复旦大学附属华山医院抗生素研究所朱德妹 教授主要内容临床微生物学概论细菌的耐药性及耐药机制主要细菌的耐药性变迁及实验室诊断细菌耐药性监测细菌耐药性的防治临床常见的致病菌G（）：金葡菌，表葡菌，-链球菌，-溶链（A、B组），肺链，肠球菌G（）：需氧球菌：脑膜炎和淋病奈瑟球菌，卡他莫拉菌需氧杆菌：不动，假单胞，粪产碱杆菌需氧和兼性厌氧：肠杆菌科细菌，如大肠杆菌，肺 克，伤寒，志贺菌厌氧细菌：消化链球菌，脆弱拟杆菌等简述抗菌药物的作用机制细菌对抗菌药物的耐药机制细菌耐药性的遗传学基础二.细菌耐药性及耐药机制DNA引导的RNA多聚酶链霉素庆大霉素、妥布霉
2、素（氨基糖苷类）阿米卡星蛋白合成（tRNA）莫匹罗星DNARNA503050305030核糖体THFADHFAPABADNA旋转酶（解旋、螺旋）喹诺酮类利福平细胞壁蛋白合成（50S抑制剂）红霉素氯霉素克林霉素蛋白合成（30S抑制剂）细胞膜多粘菌素氯霉素乙酰转移酶细胞壁合成细胞壁合成环丝氨酸万古霉素、替考拉宁杆菌肽青霉素类头孢菌素类拉氧头孢碳青霉烯类叶酸代谢甲氧苄啶磺胺类药周质空间-内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶四环素大观霉素细菌模式图（一）抗菌药物的作用机制干扰细菌细胞壁的合成，使细菌不能生长繁殖。损伤细菌的细胞膜，破坏其屏障作用。影响细菌细胞蛋白质的合成，使细菌丧失生 长繁殖的物质基础。破坏核酸的
3、代谢，阻碍遗传信息的复制。抑制细菌叶酸代谢等。抗菌药物的主要作用靶位细胞壁合成细胞壁渗透性细胞蛋白合成核酸合成叶酸合成-内酰胺类多粘菌素类氯霉素利副平磺胺类（SMZ-TMP）糖肽类两性霉素B四环素类灰黄霉素磷霉素制霉菌素红霉素喹诺酮类环丝氨酸咪康唑林可霉素类杆菌肽酮康唑氨基苷类褐霉素（二）细菌主要的耐药机制灭活酶与钝化酶的产生抗生素渗透屏障作用靶位结构改变细菌代谢状态，营养缺陷等细菌菌膜形成耐药机制1.灭活酶和钝化酶的产生内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶氯霉素酰基转移酶MLS类抗生素钝化酶（Macrolide-Licosamide Streptogramin）-内酰胺酶分类底物谱F青霉素酶F头孢菌素酶
4、 广谱酶：青霉素类、一、二代头孢菌素 超广谱酶：三、四代头孢菌素、碳青霉烯类遗传学基础F质粒酶、染色体酶可诱导性F体质酶（固有的）、诱导酶-内酰胺酶分类Ambler A Bush Group 2大多数为质粒酶D 3 可被酶抑制剂抑制Ambler C Bush Group 1染色体介导酶B4对酶抑制剂稳定-内酰胺酶分类Ambler classBush G roup2a2b2b2c2d2e2f2A1C2dD4undeterm inedSerineG roup3Clase BM etalloB LactamaseAmp CPCITEM1,2SHV1ESBLsPSE1,3,4OXA1-11PSE2头孢
5、菌素酶碳青霉烯酶金属酶青霉素酶2be TEM SHV OXA CTX-M 其他2br TEM30-36 IR-SHV2b（ESBLs）ESBLs分类来源等电点菌种TEMTemoniera5.2-6.5大肠杆菌肺炎克雷伯菌SHVSulphydryl Variable7.0-8.2肺炎克雷伯菌OXAOxacillin5.8-8.1铜绿假单胞菌CTX-MCefotaxime5.5-8.4大肠杆菌肺炎克雷伯菌其它类：其它类：PER-1、2、VEB等等5.4铜绿、不动、肺克等其他肠杆菌科细菌氨基糖苷饨化酶氨基环醇环和多个氨基糖分子，由配糖键相连接氨基糖苷饨化酶可以对氨基糖分子的活性基团进行修饰而使之失去
6、抗菌活性不同的氨基糖苷饨化酶可饨化同一种氨基糖苷类；而同一种氨基糖苷饨化酶可饨化不同的氨基糖苷类氨基糖苷类药物结构1512343624561”2”3”4”5”6”AAC（6）AAC（3）AAC（3”）APH（2）ANT(2）氨基糖苷类钝化酶乙酰转移酶 FAAC（2）AAC（6）AAC（3）核苷转移酶 FANT（4）ANT（3）ANT（2）ANT（6）磷酸转移酶 FAPH（3）APH（3”）APH（5”）革兰阳性菌（双重功能酶）AAC（6）+APH（2）耐药机制2.抗生素渗透障碍：细胞壁障碍或细胞膜通透性的改变，抗生素无法进入细胞内达到作用靶位而发挥作用。细胞壁：类脂双层，脂多糖（LPS），阻碍
7、疏水性抗菌药物进入菌体。细胞外膜：OmpF，OmpA，OmpC孔蛋白丢失或减少，阻碍亲水性抗菌药物进入菌体。细胞内膜（胞浆膜）：产生新的能量依赖性转运系统。MexA-MexB-OprM。耐药机制3.靶位结构改变靶位酶：二氢叶酸合成酶靶位生理功能：细菌形态和活力靶位结构：MRSA的PBP2，DNA旋转酶耐药机制4.其他细菌代谢状态的改变：对氨苯甲酸产量（PABA）营养缺陷、L型细菌（无细胞壁）细菌菌膜的形成F抗菌药物不能透过整个菌膜F菌膜对抗菌药物的敏感性降低F菌膜内的细菌具有独特的生物学特征4种主要耐药机制泵出失活渗透障碍靶位改变X主要耐药机制抗菌药物抗菌药物主要作用主要作用主要耐药机制主要耐
8、药机制-内酰胺类PBPs失活-内酰胺酶PBPs亲和力降低胞壁渗透障碍糖肽类与肽聚糖前体结合 肽聚糖前体钝化修饰氨基糖苷类抑制蛋白质合成（30S亚基）钝化酶（乙酰化、磷酸化、核苷化）大环内酯类抑制蛋白质合成（50S亚基）Rrna甲基化、外排泵机制喹诺酮类抑制DNA旋转酶（DNA合成）靶位酶改变、外排泵机制（三）细菌耐药性的遗传学基础染色体介导耐药质粒介导的耐药1.染色体介导的耐药性耐药基因位于染色体，随细菌分裂传至后代突变频率低：105109通常只对1，2种类似药物耐药产生或消失和药物存在无关耐药菌生长分裂变慢，竞争力变弱居次要地位2.质粒介导的耐药性染色体外的DNA耐药质粒：R.plasmid
9、类型：F接合型（Conjugative plasmid）耐药决定因子耐药转移因子F非接合型（Nonconjugative plasmid）耐药决定因子转移方式：F接合型：接合转移F非接合型：转化，转导等方式 耐药基因的转移方式转化 Transformation转导 Transduction接合 Conjugation转座 Transposition接合（Conjugation）方式：通过耐药菌性菌毛和敏感菌菌体 的直接沟通，由耐药菌将耐药质粒边复制边转移给敏感菌。细菌：革兰阴性菌，特别是肠道细菌。发生频率：102108临床意义：可造成耐药菌的爆发流行，种间，属间，牲畜与人细菌耐药性细菌细菌对抗
10、菌药物耐药的生物学表型既可以通过突变成为细菌的特征传给子代,又可以接受或转移耐药基因,导致耐药基因扩散耐药基因可编码多种耐药机制来抵制抗菌药物新的耐药细菌新的耐药细菌突变突变XX抗菌药物耐药性的出现敏感细菌耐药细菌耐药细菌耐药基因转移耐药基因转移抗菌药物抗菌药物抗菌药物均具有选择耐药细菌的能力，其广泛使用可导致选择性压力增加。每一种新抗菌药物使用于临床后不久就可产生耐药性抗生素总量的消耗与耐药性选择有密切关系耐药菌株极少xx耐药菌株为主耐药菌株为主抗生素暴露抗生素暴露xxxxxxxxxx抗菌药物的选择性压力三.主要细菌的耐药性变迁及实验室诊断细菌耐药性的现状和变迁实验室诊断由病原微生物引起的感
11、染仍然是当前人类健康的主要威胁据2019年WHO的统计资料，因感染而死亡的人数占全部死亡人数的第二位。而在全球因感染死亡人数中，发展中国家几乎占到了50抗生素的不断研发大大地降低了传染性疾病的发病率和死亡率，但细菌耐药性的出现和蔓延却严重地威胁和破坏着人类抗感染治疗的效果随着国际旅游事业的发展和经济贸易的全球化，使耐药菌株也在国际间广泛传播，从而导致细菌对抗生素耐药现象的全球化1.细菌耐药性的现状和耐药性变迁细菌耐药性发生的重要事件 1910 奎宁 1939 磺胺 1941 青霉素 1946 链霉素 1957 氯喹 1961 耐甲氧西林金葡菌（MRSA）1977 多重耐药霍乱弧菌 1982 产
12、ESBL 的克雷伯菌 1987 多重耐药伤寒沙门菌 1989 耐万古霉素肠球菌（VRE）2019 万古霉素耐药金葡菌（VRSA）细菌耐药性是全球性问题 1982年，ESBLs在催产克雷伯菌中首次发现F20世纪末，产生的菌种，酶的品种，地理区域 1989年，耐万古霉素肠球菌（VRE）F1993年，20倍 90年代：MRSA出现和PRSP广泛流行 2019年：对万古霉素敏感性降低的金葡菌在日本首次发现 2019年，美国发现了VRSA金葡菌金葡菌青霉素耐药金葡菌青霉素耐药金葡菌金葡菌耐药性的进化甲氧西林耐药金葡菌甲氧西林耐药金葡菌(MRSA)甲氧西林甲氧西林1970s青霉素青霉素1950s万古霉素万
13、古霉素1990s万古霉素耐药肠球菌万古霉素耐药肠球菌(VRE)2019万古霉素中度耐药万古霉素中度耐药金葡菌金葡菌(VISA)2019 万古霉素万古霉素耐药耐药金葡菌金葡菌近年来革兰阳性菌的变迁主要表现为金葡菌(尤其是MRSA)耐药株感染的发生率增多凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)感染增多耐青霉素肺炎链球菌（PISP，PRSP）的出现和传播万古霉素耐药肠球菌（VRE）耐青霉素和耐头孢菌素类草绿色链球菌上海地区的细菌耐药性监测资料近年来革兰阴性菌的变迁主要表现为TEM-1流感嗜血杆菌大肠埃希菌对氟喹诺酮类的耐药率上升快克雷伯菌属及肠杆菌科细菌中的ESBLs肠杆菌属细菌中，尤其是阴沟肠杆菌中高产Amp
14、C 酶非发酵菌特别是不动杆菌、铜绿假单胞菌中的泛耐药株嗜麦芽窄食单胞菌、黄杆菌固有耐药株对碳青霉烯类的耐药性上海地区的细菌耐药性监测资料四.抗感染药物的敏感性试验与 耐药细菌的实验室检测1.抗感染药物的敏感性试验药敏试验 测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长的能力,称抗菌药物对细菌的抑菌试验，或称细菌对药物的敏感性试验。药敏试验的目的供临床医师选用抗菌药物时的参考细菌耐药性监测和耐药性变迁评价新抗菌药物的药效学特征对细菌耐药谱分析和分型有助于某些菌种的鉴定作为医院内感染流行病学调查的手段之一药物敏感性试验测定的方法稀释法F试管稀释法（肉汤稀释法）F平板稀释法（琼脂稀释法）扩散法（纸片法）FKi
15、rby-baure(K-B)法FStockes法E-Test稀释法 原理：以一定浓度的抗菌药物与含有被测菌株的培养基进行一系列的对倍稀释经培养后，肉眼观察细菌生长的情况 最低抑菌浓度（MIC）：肉眼观察能抑制细菌生长的最低一管药物浓度（Minimal inhibitory concentration MIC）几个重要的指标 MIC(最低抑菌浓度 minimal inhibitory concentration)F在体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度 MBC(最低杀菌浓度 minimal bactericidal concentration)F在体外能够使细菌总数减少(杀灭)99.9%以上的最低
16、药物浓度。MIC50、MIC90F在一批实验中能抑制50%或90%受试菌所需的MIC。MBC50 MBC90F在一批实验中能使50%或90%受试菌的活菌数减少99.9%所需的MBC。临界浓度（breakpoint）F根据抗菌药物抑制细菌生长所需要的MIC，结合常用剂量时该药所能达到的血药浓度，划定细菌对各种抗菌药物敏感或耐药的界限。扩散法 原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，根据抑菌圈的大小即可推知该药物的最低抑菌浓度（MIC）。纸片扩散法（K-B）操作步骤纸片法药敏和MIC法的回归直线图Log2MIC
17、MIC7128最664532低41638抑2412菌01-10.5浓-20.25-30.125度-40.06-50.03-60.0156101418222630343842抑菌圈直径耐药中敏高敏100株临床菌株100对MIC和抑菌圈直径负相关（r=-0.9）中敏：12-20mmE-试验（E-Test）原理：基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料纸条中向药敏琼脂中扩散，在试条周围浓度范围内检测菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。E-test综合了稀释法和扩散法的原理和特点，直接定量测出药物对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）。E-试验（E-Test）菌液，药敏平板 同K-B法E-Test条
18、宽5mm，长60mm150mm平皿贴6条90mm平皿贴1条如何阅读药敏试验报告 S 高度敏感 I 中度敏感（中介）R 高度耐药 临床意义？高度敏感当一种细菌引起的感染，用该种药物常用剂量治疗有效，这种细菌即对该药高度敏感。即常规用药时达到的平均血浓度超过对细菌MIC的5倍以上。中度敏感当细菌引起的感染，仅在应用高剂量抗菌药物时才有效，或者细菌处于体内抗菌药物浓缩部位，如尿液，胆汁等才被抑制，这种细菌对该药呈中度敏感。常规用药时达到平均血浓度，一般相当于或略高于对细菌的MIC高度耐药 药物对某一细菌的MIC高于药物在血或体液中可能达到的浓度；有时细菌能产生灭活抗菌药物的酶，则不论其MIC值大小如
19、何，仍应判定该菌为耐药。2.耐药细菌的实验室检测和药敏试验特点耐甲氧西林葡萄球菌的检测苯唑西林：1ug/片F金葡菌 11-12mmF凝固酶阴性葡萄球菌 17mm4%NaCl-6ug/ml苯唑西林盐平板F培养条件：35，24-48小时F结果：1个菌落生长，判定为甲氧西林耐药（MR）菌株头孢西丁：30ug/片F金葡菌 19mmF凝固酶阴性葡萄球菌 24mm分子生物学方法:PCR扩增mecA基因药敏试验的特点-lactamasesmecA抗菌药物抗菌药物MSSA(甲氧西林敏感金葡菌)/除青霉素外大多敏感MRSA(甲氧西林耐药金葡菌)大多耐药（万古霉素除外）耐万古霉素肠球菌检测 万古霉素纸片扩散法F含
20、量：30ug/片F结果：透射光，抑菌圈内出现薄雾状或任何其他生长或抑菌圈14mm均表示耐药F抑菌圈15-16mm为中度敏感，MICF抑菌圈17mm判定为敏感 万古霉素耐药确证试验F含6ug/ml万古霉素的MH平板F1-10ul 0.5 5MacFarland Standard菌悬液F35，24小时，1个菌落生长即判定为耐药 分子生物学方法:VanA、VanB、VanC 等基因药敏试验的特点耐药基因特性VAN AVAN-R、TEC-R VAN BVAN-R、TEC-SVAN CVAN-I、TEC-SVRE菌株耐万古霉素肠球菌可测试对氯霉素、红霉素及利福平的敏感性耐青霉素肺炎链球菌的检测苯唑西林：
21、1ug/片抑菌圈直径20mm为青霉素敏感株（MIC0.06ug/ml）抑菌圈直径19mm可能为青霉素耐药、中敏或敏感株，必须进行青霉素MIC测定。F 0.06ug/ml S（PRSP）F0.125-1ug/ml I（PISP）F 2ug/ml R（PRSP）药敏试验的特点PSSP青霉素、阿莫西林等-内酰胺类高度敏感对红霉素、克林霉素、氯霉素耐药率较高PISP+PRSP青霉素耐药，部分菌株对头孢曲松等第三代头孢菌素耐药；但对万古霉素、和碳青霉烯类等均呈敏感；对红霉素、克林霉素、氯霉素耐药率更高ESBL细菌的检测筛选试验F头孢泊肟：10ug/片 22mmF头孢他啶：30ug/片 22mmF头孢噻肟
22、：30ug/片 27mmF头孢曲松：30ug/片 25mmF氨曲南：30ug/片 27mm任何一种以上药物进行筛选，出现上述结果疑为ESBL产生株。ESBL细菌的检测确证试验F头孢他啶（30ug/片）、头孢他啶/克拉维酸（30/10ug）F头孢噻肟(30ug/片)、头孢噻肟/克拉维酸（30/10ug）上述任何一种组合中复方制剂的抑菌圈直径与单药抑菌圈直径相比，5mm可判定为ESBL产生株。药敏试验的特点 ESBLs菌株主要为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其他的肠杆菌科细菌和非法酵菌中亦可存在 可水解各种广谱-内酰胺类抗生素包括第三代的头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松以及头孢吡肟和氨曲南等含氧亚氨基侧链
23、的头孢菌素 多数可被酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦所抑制 对亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类高度敏感，对头霉素类、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦等酶抑制剂复方制剂多数仍呈敏感 对具非-内酰胺结构的抗菌药物如氨基糖苷类、氟喹酮类等的耐药率亦较非产酶株高 AmpCESBL水解头孢西丁水解头孢西丁+-水解头孢曲松等三代头孢菌素水解头孢曲松等三代头孢菌素+酶抑制剂抑制酶抑制剂抑制-+邻氯西林抑制邻氯西林抑制+-AmpC酶的检测AmpC酶和ESBL酶的特点产AmpC酶菌株主要发生在肠杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属、沙雷菌属何家单胞菌属细菌中对头霉素类、第三代头孢菌素和酶抑制剂复方制剂耐药，并可
24、同时对氟喹酮类和氨基糖苷类耐药对第四代头孢菌素头孢吡肟和碳青霉烯类敏感如为ESBLs+AmpC酶菌株第四代头孢菌素头孢吡肟亦耐药药敏试验的特点抗菌药物合理应用的几个问题汪复；中国抗感染化疗杂志；2019:5(1):13有关耐药细菌感染的抗菌药物选用有关耐药细菌感染的抗菌药物选用 请阅读请阅读五.细菌耐药性监测细菌耐药性的危害性耐药菌引起的感染治疗无效，发病率和病死率增加。病程延长，住院天数增加，床位周转率低。花费大量的抗菌药物，使国家药政开支增加，严重影响国民经济发展。危害人类健康，对婴幼儿和老年人、免疫机制低下者的生命构成威胁。目的和意义将感染性疾病的发病率和病死率将到最低合理使用抗菌药物，
25、防止滥用，延缓耐药性发生。有助于预防、控制和遏制本地的、地区的以及全国的耐药性发生发展。制定修订经验处理和标准化的用药指南，修订国家药典以提供信息。为国家制订研制抗菌药物和改造老抗菌药物提供信息国外动态世界卫生组织（WHO）60年代F设有专题组研究细菌耐药性的防治76年F制订了标准化的药物敏感性试验操作方法(纸片法及试验材料的质量标准)，组织了一次国际性的协作。84年FWHO西太区组织了本地区细菌耐药性监测协作组88年F统一方案进行细菌耐药性监测FWHONET系统进行数据统计分析F目前已发展到WHONET5.4国外动态世界卫生组织（WHO）95年，美国微生物协会专题讨论F立即组织国家一级的细菌
26、耐药性监测系统F加强对医疗卫生工作者的教育和培训，提高合理运用抗菌药物的水平。F加强有效的新抗菌药物的开发01年，WHO制订了“抑制细菌耐药性的全球性策略”，强调了建立细菌耐药性监测系统的重要性。美国医院监测系统（NNIS）、欧洲耐药性监测网（EARSS）、加拿大细菌耐药性监测网（CBSN）国内1988年WHO西太区办在上海和北京建立了两个细菌耐药性监测中心F北京：卫生部中国药品生物制品检定所F上海：复旦大学附属华山医院抗生素研究所监测方案、实验方法和材料均按WHO规定的统一标准。现在细菌耐药监测工作已发展到广州、武汉和沈阳等地。细菌耐药性监测的主要内容建立耐药监测网标准化的监测方法质量控制耐
27、药菌种库数据的处理和管理耐药性的防治措施合理使用抗菌药物建立细菌耐药性监测网严格掌握用药的适应症掌握适当的剂量与疗程耐药性的防治措施严格执行消毒隔离制度隔离耐药菌感染的患者定期检查医务人员带菌情况防止耐药菌的交叉感染耐药性的防治措施加强药政管理抗菌药物必须凭处方供应控制新抗菌药物的审批标准，质量监督严格控制医用抗菌药物为畜用头霉素类抗生素耐药性的防治措施新抗菌药物的寻找和研制针对耐药发生的机制，抗菌药物的结构开发新药。耐药性的防治措施新抗菌药物的寻找和研制F寻找适当的酶抑制剂，生产新的内酰胺抗生素/酶抑制剂复方制剂目前已有三种酶抑制剂F克拉维酸 舒巴坦 三唑巴坦。有五种酶抑制剂与内酰胺类的复方制剂F优立新（氨苄西林/舒巴坦）F特治星（哌拉西林/三唑巴坦）F舒普深（头孢哌酮/舒巴坦）F安美汀（奥格门汀/克拉维酸）F特美汀（替卡西林/克拉维酸）本章节主要掌握的内容细菌的耐药性主要的耐药机制主要细菌的耐药性变迁抗感染药物的敏感性试验主要细菌的实验室诊断及药敏试验特点
