1、临床免疫分析发展趋势临床免疫分析发展趋势及化学发光技术应用及化学发光技术应用-化学发光化学发光-荧光偏振荧光偏振-微粒子酶放大化学发光微粒子酶放大化学发光-电化学发光电化学发光-时间分辨免疫荧光时间分辨免疫荧光-抗体芯片抗体芯片-透射和散射比浊透射和散射比浊-流式细胞技术流式细胞技术-免疫扩散免疫扩散-免疫沉淀免疫沉淀/免疫凝集免疫凝集-ELISA-IFA-RIA-ICT 免疫学和自动化技术在临床免疫学诊断领域中的应用将大大加速标记免疫学分析技术发展历程标记免疫学分析技术发展历程 免疫荧光分析免疫荧光分析(Coons,1941)(Coons,1941)放射免疫分析放射免疫分析(Berson(B
2、erson和和Yalow,1960)Yalow,1960)酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析 (Engvall,1971)(Engvall,1971)金标免疫分析金标免疫分析(Faulk(Faulk和和Taylor,1971)Taylor,1971)化学发光免疫分析化学发光免疫分析(Arakawa(Arakawa，1977)1977)时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(Soini(Soini和和HemmilaHemmila，1979)1979)电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(Leland,1990)(Leland,1990)方法中国欧美放射免疫法（RIA）1.兴起于20世纪70年代，
3、现仍普遍使用于县级以上医院；2.产品处于衰退期；3.厂商试剂与仪器共同开发，试剂基本系列化。1.兴起于20世纪60年代，现已基本退出临床应用；2.产品生命周期已终结；3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂基本系列化 酶联免疫法（ELISA）1.兴起于20世纪80年代，现普遍使用于各级临床机构，为我国临床免疫诊断的基本方法；2.产品处于成熟期；3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂尚未系列化。1.兴起于20世纪70年代，现仍在临床应用；2.产品处于衰退期；3.厂商试剂和仪器共同开发，试剂基本系列化。化学发光免疫法（CLIA）1.导入于20世纪90年代，逐步进入各大中医院；2.产品处于快速成长期；3.正逐步实
4、现试剂和仪器共同开发，试剂逐步系列化 1.兴起于20世纪80年代，现已被临床普遍使用，成为临床免疫诊断的支柱方法；2.产品处于成熟期；3.厂商试剂与仪器共同开发，仪器自动化程度高，试剂系列化状态好。技术成熟度高技术成熟度高 放射性（放射性（125125 I I）污染和危害）污染和危害125 125 I I 的半衰期短，试剂有效期短的半衰期短，试剂有效期短 标记物标记物125125 I I 的稳定性差，批间、批内的稳定性差，批间、批内的变异较大的变异较大 标准曲线有效期短，必须每次定标标准曲线有效期短，必须每次定标 操作繁琐，出报告时间长操作繁琐，出报告时间长 无法保存备用。无法保存备用。Ros
5、alyn Yalow,1977v成本低廉成本低廉v定性、半定量和定量均可以检测定性、半定量和定量均可以检测vO.DO.D值在低中浓度范围与酶活性呈线性关系值在低中浓度范围与酶活性呈线性关系v可以肉眼简单判读或酶标仪准确判读结果可以肉眼简单判读或酶标仪准确判读结果酶免疫分析技术酶免疫分析技术 (EIA)(EIA)灵敏度高，检测低限达灵敏度高，检测低限达1010-19-19molmol 测定范围宽，可达测定范围宽，可达9 9个数量级个数量级 自动化程度高，操作简单自动化程度高，操作简单 试剂稳定性好，无污染有效期试剂稳定性好，无污染有效期6 62424月月BAYER ACS 180AxSYMEle
6、csys 2010 SystemAccess 2 Immunoassay System 最先进的免疫学分析技术之一最先进的免疫学分析技术之一 非开放性试剂系统；非开放性试剂系统；试剂价格过高试剂价格过高 电化学发光免疫测定（电化学发光免疫测定（Electrochemiluminescence immunoassay,ECLI）是电化学发光（）是电化学发光（ECL）和免疫测定相结合）和免疫测定相结合的产物。的产物。它的标记物的发光原理与一般的化学发光（它的标记物的发光原理与一般的化学发光（CL）不同，）不同，是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包是一种在电极表面由电化学引发的
7、特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。括了电化学和化学发光二个过程。ECL与与CL的差异在于的差异在于ECL是电启是电启动发光反应，而动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。是通过化合物混合启动发光反应。Elecsys 2010 System免疫学检验技术发展趋势快速简便快速简便精确灵敏精确灵敏集成高通量集成高通量v 金标免疫层析检测金标免疫层析检测v 磁珠免疫层析检测磁珠免疫层析检测v 化学发光化学发光v 时间分辨荧光时间分辨荧光v AlphaScreenAlphaScreen v 阵列芯片阵列芯片v 液相悬浮芯片液相悬浮芯片 简史：本世纪简史：本世纪7070年代
8、中期年代中期ArakaweArakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。常规检测手段。原理：发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，原理：发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同产生激发态的中间
9、体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与催化的酶的量成正比额与催化的酶的量成正比,由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量的含量.CLIACLIA试剂盒国产化程度已经较高，质量与国外产品的差距逐渐减小。试剂盒国产化程度已经较高，质量与国外产品的差距逐渐减小。缺乏国产化的自动检测仪器缺乏国产化的自动检测仪器化学发光免疫分析发展史化学发光免疫分析发展史 CLIACLIA发光检测方法分类和对比发光检测方法分类和对比
10、类型类型 原理原理 试剂试剂 发光类型发光类型化学发光免疫分析化学发光免疫分析(CLIA)化学发光物质直接标化学发光物质直接标记抗原记抗原(体体)吖啶酯吖啶酯异鲁米诺异鲁米诺 闪光型闪光型化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析(CLEIA)在酶免疫分析完成后在酶免疫分析完成后加入底物加入底物鲁咪诺系统鲁咪诺系统AMPPD系统系统 辉光型辉光型电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析（ELCIA)电致化学发光与电化电致化学发光与电化学手段相结合学手段相结合三联吡啶钌三三联吡啶钌三丙氨系统丙氨系统 闪光型闪光型荧光免疫分析荧光免疫分析根据抗原抗体反应的原理，根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标
11、先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原组织或细胞内的相应抗原（或抗体（或抗体）荧光素荧光素 闪光型闪光型【化学发光免疫分析种类】1.直接化学发光A 吖啶酯发光原理：原理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物，在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。特点：特点：发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。
12、代表仪器：代表仪器：拜耳公司的ACS180，雅培Architect。原理图【化学发光免疫分析种类】B 异鲁米诺发光原理：原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在3秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的缺点。代表仪器：代表仪器：德国BykSangtec公司的LIAISON原理图2 2、酶促化学发光或持久发光、酶促化学发光或持久发光原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶（原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶（AP)AP)或辣根过氧化物酶或辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)标记在抗体或抗原上，固相抗体或抗原与标记在抗体或抗原上，固相抗体或抗原与AP
13、AP或或HRPHRP标记的抗原、标记的抗原、抗体复合物在发光底物抗体复合物在发光底物AMPPDAMPPD或或LuminolLuminol作用下，持续发出可见光，作用下，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。通过光电倍增管读取光信号。特点：特点：碱磷酶体系：水解反应，起光较慢，发光强度较弱，灵敏度碱磷酶体系：水解反应，起光较慢，发光强度较弱，灵敏度 较较高。高。辣根酶体系：氧化还原反应，起光较快，发光强度较大。辣根酶体系：氧化还原反应，起光较快，发光强度较大。代表仪器和试剂：代表仪器和试剂：进口品牌：强生进口品牌：强生 VitrosECiVitrosECi（鲁米喏），美国贝克曼公司的（鲁米喏
14、），美国贝克曼公司的ACCESS ACCESS（AMPPDAMPPD）。国产主要厂家：郑州安图国产主要厂家：郑州安图（HRP-LUMINOL)HRP-LUMINOL)、北京源德、北京源德（HRP-HRP-LUMINOL)LUMINOL)、泰格可信、泰格可信（HRP-LUMINOL)HRP-LUMINOL)、科美东雅、科美东雅(AMPPD)(AMPPD)、威海威高威海威高（HRP-LUMINOL)HRP-LUMINOL)等等【化学发光免疫分析种类】VitrosECiVitrosECi（鲁米喏）（鲁米喏）原理图原理图英国强生 VitrosECi（鲁米喏）3、电化学发光 原理：原理：纳米磁珠分离后的
15、三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。特点：特点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程约需25秒，测试速度慢。代表仪器：代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010和ELECSYS 2010。【化学发光免疫分析种类】电化学发光检测技术（电化学发光检测技术（ELECSYS 1010 ELECSYS 2010ELECSYS 1010 ELECSYS 2010）原理图原理图罗氏 （Roche Diagnostics）1 1 结合了活化的三联吡啶钌衍生物即结合了活化的三联吡啶钌
16、衍生物即Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+N+N羟羟基琥珀酰胺酯（基琥珀酰胺酯（NHSNHS）的抗）的抗-HBs-HBs和结合了生物素的和结合了生物素的抗抗-HBs-HBs与待测血清同时加入一个反应杯中孵育与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9 9分钟分钟 操作步骤2 2将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育育9 9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、抗抗-HBs-HBs连接为一体，形成双抗体夹心法连接为一体，形成双抗体夹心法 3 3 蠕动泵将形成的蠕动泵将形成的 Ru(bpy)Ru(bpy
17、)3 3 2+2+抗体抗原抗体磁抗体抗原抗体磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的抗面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的抗-HBs-HBs（与（与生物素结合的和与生物素结合的和与Ru(bpy)Ru(bpy)3 3 2+2+结合的抗体）也被吸出测结合的抗体）也被吸出测量室量室 4 4 蠕动泵加入含三丙胺（蠕动泵加入含三丙胺（TPATPA）的缓冲液，同时电极加）的缓冲液，同时电极加电压，启动电压，启动ECLECL反应过程反应过程5 5 终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，终止电压，移开磁珠，加入清
18、洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定准备下一个样品测定 4 4、免疫荧光、免疫荧光4.14.1时间分辨免疫荧光（时间分辨免疫荧光（TRFIA)TRFIA)美国美国 PerkinElmerPerkinElmer 芬兰芬兰 WallacWallac 新波新波 达安基因达安基因4.24.2光激化学发光（光激化学发光（LicaLica）博阳博阳 4.34.3多种技术综合多种技术综合 美国雅培美国雅培 AxSYM MEIAAxSYM MEIA 日本东曹日本东曹MEIAMEIA【化学发光免疫分析种类】基本原理基本原理 TRFIA是用是用镧系稀土元素螯合物镧系稀土元素螯合物标记抗体或抗原，检标记抗体或抗原，检测标本中相应的抗原或抗体，用时间分辨荧光免疫分析检测测标本中相应的抗原或抗体，用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。量分析。TRFIA
