1、放射免疫分析放射免疫分析 Radio immunoassayRadio immunoassay （RIARIA）王海龙王海龙2006.032006.031探讨的主要内容探讨的主要内容 基本概念基本概念 基本原理基本原理 放射免疫方法的建立放射免疫方法的建立 放射免疫分析的要求和影响因素放射免疫分析的要求和影响因素 免疫放射的基本概念免疫放射的基本概念 放免分析的应用放免分析的应用2第一节第一节 放射免疫概述放射免疫概述3一、概念一、概念 一种体外超微量分析法，它是将具有高灵一种体外超微量分析法，它是将具有高灵敏度的放射性核素（如敏度的放射性核素（如125125I I）示踪技术与高度示踪技术与高
2、度特异性的免疫化学技术二者结合建立起来的分特异性的免疫化学技术二者结合建立起来的分析方法析方法。用于定量测定受检标本中的抗原。用于定量测定受检标本中的抗原。特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。4二、基本原理二、基本原理1 1、标记抗原（、标记抗原（AgAg*）、非标记抗原（非标记抗原（AgAg）和特异性抗体和特异性抗体（AbAb）三者同时存在于一个反应体系，标记抗原和非标三者同时存在于一个反应体系，标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，两者相互竞争记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，两者相互竞争结合特异性抗体。结合特异性抗体。Ag
3、Ag*+AbAb=Ag=Ag*Ab Ab +Ag Ag AgAb AgAb =52 2、作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，非标、作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，非标记抗原是变化的。标记抗原与非标记抗原与限量的抗记抗原是变化的。标记抗原与非标记抗原与限量的抗体发生竞争性结合。反应达到平衡时，标记抗原抗体体发生竞争性结合。反应达到平衡时，标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。非标记抗原量增加，相应地结合较多的抗体，从非标记抗原量增加，相应地结合较多的抗体，从而抑制标记抗原对抗体的结合，使标记抗原抗体复合而抑制标记抗原对抗体的结合，
4、使标记抗原抗体复合物相应减少，游离的标记抗原相应增加，亦即抗原抗物相应减少，游离的标记抗原相应增加，亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比反比。63 3、将、将AgAg*Ab Ab与游离与游离AgAg*分开，分别测定其放射性强度，分开，分别测定其放射性强度，就可算出结合态的就可算出结合态的AgAg*（B B）与游离态的与游离态的AgAg*（F F）的的比值（比值（B/FB/F），），或算出其结合率或算出其结合率 B/(BB/(BF)F)，这与标这与标本中的抗原量呈函数关系。用一系列不同剂量的标本中的抗原量呈函数关系。用一系列不
5、同剂量的标准抗原进行反应，计算相应的准抗原进行反应，计算相应的B/FB/F，可以绘制出一条可以绘制出一条剂量反应曲线。剂量反应曲线。4 4、受检标本在同样条件下进行测定，计算、受检标本在同样条件下进行测定，计算B/FB/F值，值，即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。7剂量反应曲线剂量反应曲线 8放射免疫分析原理示意图放射免疫分析原理示意图 9三、放射免疫测定的优点三、放射免疫测定的优点1）灵敏度高）灵敏度高 大分子，大分子，ng/ml水平；小分子，水平；小分子，pg/ml水水 平。平。2）特异性好）特异性好3）精确地定量）精确地定量4）操作方法越
6、来越简便）操作方法越来越简便5）抗体的来源日益广泛，放射免疫可测定的微量物）抗体的来源日益广泛，放射免疫可测定的微量物 质越来越多。质越来越多。10第二节第二节 放射免疫基本试剂放射免疫基本试剂11一、标准品一、标准品 标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被测物质的量，品的量用来表示被测物质的量，标准抗原的基本要求：标准抗原的基本要求：(1)(1)标准抗原与待测抗原的免疫性必须一致，即它们与标准抗原与待测抗原的免疫性必须一致，即它们与 抗体的亲和力和特异性应相同。抗体的亲和力和特异性应相同。(2)(2)抗原必须纯度高。抗原必须纯
7、度高。(3)(3)标准抗原的量必须准确。标准抗原的量必须准确。(4)(4)标准抗原应有很好的稳定性。标准抗原应有很好的稳定性。12二、标记物二、标记物1 1、标记抗原应具备：、标记抗原应具备：比放射性高，以保证方法的灵敏度；比放射性高，以保证方法的灵敏度；免疫活性好；免疫活性好；所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较 长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；标记简便、易防护。标记简便、易防护。13 2 2、标记用的核素有放射、标记用的核素有放射射线和射线和射线两大类。射线两大类。前者主要为前者主要为131131I
8、 I、125125I I、5757CrCr和和6060CoCo；后者有后者有1414C C、3 3H H和和3232P P。放射性核素的选择首先考虑比活性。放射性核素的选择首先考虑比活性。125125I I是目是目前常用的前常用的RIARIA标记物。标记物。标记标记125125I I的方法可分两大类，即直接标记法和间接的方法可分两大类，即直接标记法和间接标记法。标记法。14三、抗体（抗血清）三、抗体（抗血清）抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。目前常以抗原免疫年轻、健康的纯种小动物而诱目前常以抗原免疫年轻、健康的纯种小动物而诱发产生多克隆抗体，选取发产生
9、多克隆抗体，选取特异性高、亲和力强及特异性高、亲和力强及滴度滴度高的血清，为高的血清，为RIARIA所用。所用。15四、四、B与与F分离剂分离剂 以以2%2%加膜活性炭溶液为例，加膜活性炭溶液为例，2%2%加膜活性炭加膜活性炭溶液的配制：溶液的配制：活性炭活性炭2 2g g（杭州木材厂生产，森工牌杭州木材厂生产，森工牌732732型）型）右旋糖酐右旋糖酐T T20200.2g0.2g加加0.10.1mol/L PBS mol/L PBS 至至100100mlml电磁搅拌电磁搅拌1 1h h，然后置于普通冰箱待用。然后置于普通冰箱待用。16五、缓冲液五、缓冲液 目前最常用的缓冲液有下列几种：磷酸
10、盐缓目前最常用的缓冲液有下列几种：磷酸盐缓冲液；醋酸盐缓冲液；冲液；醋酸盐缓冲液；TrisTris HClHCl缓冲液；缓冲液；硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。保护蛋白保护蛋白防腐剂防腐剂酶抑制剂酶抑制剂阻断剂阻断剂载体蛋白载体蛋白17六、试剂盒要注意的问题六、试剂盒要注意的问题1 1）检查药盒的数量与药盒说明书是否一致（一般）检查药盒的数量与药盒说明书是否一致（一般药盒内装有标记抗原、抗体、标准品、分离剂）。药盒内装有标记抗原、抗体、标准品、分离剂）。2 2）标准品，抗血清、标记抗原要在）标准品，抗血清、标记抗原要在-20-20以下保存，以下保
11、存，加样前要将标准品、抗血清、标记抗原充分混匀，加样前要将标准品、抗血清、标记抗原充分混匀，标记抗原最好当天溶解，当天使用。标记抗原最好当天溶解，当天使用。3 3）分离剂不能冷冻保存应保存在）分离剂不能冷冻保存应保存在44冰箱内。冰箱内。4 4）缓冲液，每种药盒的缓冲液不相同，不能相互）缓冲液，每种药盒的缓冲液不相同，不能相互使用。使用。18第三节第三节 放射免疫测定放射免疫测定19一、样品的处理一、样品的处理 血清、血浆（抗凝），尿液，组织匀浆血清、血浆（抗凝），尿液，组织匀浆 用蒸馏水或缓冲液作适当稀释。用蒸馏水或缓冲液作适当稀释。血清或血浆抽入试管血清或血浆抽入试管-20-20保存保存3
12、 3个月，个月，-70-70保存保存6 6个月。个月。20二、测定方法二、测定方法用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原抗体的竞争抑制反应、抗体的竞争抑制反应、B B和和F F的分离及放射性的测量。的分离及放射性的测量。21T T：总放射性总放射性,只有标记抗原时的放射性只有标记抗原时的放射性。B B0 0：待测抗原剂量为零时的最大结合。待测抗原剂量为零时的最大结合。NSBNSB：非特异结合，标记抗原结合在非抗血清的物质非特异结合，标记抗原结合在非抗血清的物质上的部分。上的部分。非特异结合率：非特异结合率：（NSB/TNSB/T）100 100%最
13、大结合率最大结合率：（B B0 0/T/T）100 100%22加样程序加样程序 由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述如下：而出现两种加样程序，分述如下：（一）抗原抗体反应（一）抗原抗体反应将受检标本、标记抗原和抗血清按顺序定量加将受检标本、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定的温度下进行竞争抑制反应。入小试管中，在一定的温度下进行竞争抑制反应。37 37，2 2h h或或44过夜。过夜。231 1、平衡饱和加样程序、平衡饱和加样程序 （1 1）基本原理：基本原理：让标记让标记AgAg和非标和非标AgAg与与Ab
14、Ab以相同的机以相同的机率反应，反应达到平衡后中止反应，分离结合和游离率反应，反应达到平衡后中止反应，分离结合和游离的标记的标记AgAg。（2 2）加样程序：一般先加标准物或被测样品，再加加样程序：一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。24试剂试剂TNSBB0B1-B5样品样品缓冲液缓冲液-200100-标准液标准液-100-样品样品-100抗血清抗血清-100100100125I-IL-21001001001001
15、00 摇匀摇匀 424h PR分离剂分离剂-500500500500IL-2 RIA加样程序（加样程序（L）252 2、顺序饱和加样程序、顺序饱和加样程序 （1 1）基本原理：先将标准物或样品与抗血清混匀，基本原理：先将标准物或样品与抗血清混匀，免疫反应免疫反应12122424h h，使抗原与抗体充分结合，然后使抗原与抗体充分结合，然后再加入标记抗原，与抗体反应再加入标记抗原，与抗体反应6 62424h h，最后分离最后分离B B与与F F，这称为顺序饱和分析法。这称为顺序饱和分析法。（2 2）应用顺序饱和加样，第）应用顺序饱和加样，第1 1次温育时间可以长，次温育时间可以长，而第而第2 2次
16、温育时间要短，这样可以提高灵敏度。次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。26试剂试剂TNSBB0B1-B5样品样品缓冲液缓冲液-300200-标准液标准液-200-样品样品-200抗血清抗血清-100100100 摇匀摇匀 448h 125I-URO100100100100100 摇匀摇匀 424h PR分离分离剂剂-500500500500尿钠素尿钠素 RIA加样程序（加样程序（L）27（二）（二）B B、F F分离技术分离技术在在RIARIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量反应中，标记抗原和特异性抗体的含量极微，形成的标记抗原抗体复合物（极微，形成的标记抗原抗体复合物（B B）不能自行不能
17、自行沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标记抗原（以完成与游离标记抗原（F F）的分离。的分离。281 1、非特异性分离法、非特异性分离法(1)(1)吸附法：利用表面活性物质将反应液中的小吸附法：利用表面活性物质将反应液中的小分子游离部分分子游离部分F F吸附，通过离心，将吸附，通过离心，将F F沉淀，使大沉淀，使大分子结合物分子结合物B B留在上清液中，而达到分离的目的。留在上清液中，而达到分离的目的。29(2)(2)过滤法：反应液中过滤法：反应液中B B与与F F混合物在通过一定规格混合物在通过一定规格孔径的滤膜时，大分子不会
18、通过滤膜孔被阻留在孔径的滤膜时，大分子不会通过滤膜孔被阻留在滤膜上，小分子游离的放射性物质滤膜上，小分子游离的放射性物质F F被抽吸通过滤被抽吸通过滤膜而分离。膜而分离。(3)(3)聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）沉淀法：沉淀法：PEGPEG沉淀剂的主要优沉淀剂的主要优点是制备方便，沉淀完全。缺点是非特异性结合点是制备方便，沉淀完全。缺点是非特异性结合率比用第二抗体为高，且温度高于率比用第二抗体为高，且温度高于3030时沉淀物时沉淀物容易复溶。容易复溶。302 2、特异性分离法、特异性分离法(1)(1)双抗法双抗法(AbAb2 2法法)：(2)(2)固相分离法：将特性抗体固相分离法：将特性抗
19、体(第一或第二抗体第一或第二抗体)或抗原结合在固相物质。或抗原结合在固相物质。(3)(3)金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌A A蛋白分离法。蛋白分离法。31（三）放射性强度的测定（三）放射性强度的测定 B B、F F分离后，即可进行放射性强度测定。测量分离后，即可进行放射性强度测定。测量仪器有两类，液体闪烁计数仪（仪器有两类，液体闪烁计数仪（射线，如射线，如3 3H H、3232P P、1414C C等）和晶体闪烁计数仪（等）和晶体闪烁计数仪（射线，如射线，如125125、131131I I、5757CrCr等）。等）。计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为c
20、pmcpm（计数计数/分），也可用分），也可用cpscps（计数计数/秒）表示。秒）表示。32（四）标准曲线的制备（四）标准曲线的制备 用半对数纸，用半对数纸，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图。以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图。放射性强度可任选放射性强度可任选B B或或F F，亦可用计算值亦可用计算值B/(BB/(BF)F)、B/FB/F和和B/BB/B0 0（零标准管结合）零标准管结合）。标本应作双份测定，标本应作双份测定，取其平均值，在制作的标准曲线图上查出相应的受取其平均值，在制作的标准曲线图上查出相应的受检
21、抗原浓度。检抗原浓度。3334第四节第四节 放射免疫的质控放射免疫的质控35一、质量控制的目的一、质量控制的目的控制系统误差，减少偶然误差。控制系统误差，减少偶然误差。系统误差：系统误差：1 1、试剂盒的质量；、试剂盒的质量；2 2、检测仪的性状（稳定性、灵敏度）、检测仪的性状（稳定性、灵敏度）偶然误差：偶然误差：1 1、实验方法的不同；、实验方法的不同；2 2、实验人员的操作、实验人员的操作36二、放射免疫分析中测量误差的控制二、放射免疫分析中测量误差的控制 1 1选择准确性高的方法；选择准确性高的方法；2 2建立各种类型的标准；建立各种类型的标准；对标准品应规定纯度及制备方法，使用年限及贮
22、对标准品应规定纯度及制备方法，使用年限及贮存条件。存条件。3 3建立操作规程，按章操作；建立操作规程，按章操作；4 4建立可靠的检查制度。建立可靠的检查制度。375）为了达到适宜的灵敏度，在系统中抗原剂量为零）为了达到适宜的灵敏度，在系统中抗原剂量为零时的最大结合（即时的最大结合（即B0），），是测定的起点（基准）。是测定的起点（基准）。NSBNSB（非特异结合管）非特异结合管）5%25%25%曲线就能用，曲线就能用，结合率低于结合率低于20%20%曲线就不能用。曲线就不能用。38第五节第五节 放射免疫的应用放射免疫的应用39一、心血管功能类一、心血管功能类：血栓素（血栓素（TXB2）消炎痛消
23、炎痛-EDTA抗凝抗凝6-酮酮-前列腺素前列腺素F1消炎痛消炎痛-EDTA抗凝抗凝内皮素内皮素ET抑肽酶抑肽酶-EDTA降钙素基因相关肽降钙素基因相关肽抑肽酶抑肽酶-EDTA心钠素心钠素ANP抑肽酶抑肽酶-EDTA肾上腺髓质素肾上腺髓质素ADM抑肽酶抑肽酶-EDTA醛固酮醛固酮肝素抗凝肝素抗凝40二、多肽因子类二、多肽因子类 肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子TNF、IL-1、IL-2、IL-4、IL-8、IL-10、粒细胞粒细胞-集落细胞刺激因子、胰岛素样生长因子集落细胞刺激因子、胰岛素样生长因子-2、红细胞生、红细胞生成素（成素（EPO）三、脑三、脑-肠肽类肠肽类 胃动素（胃动素（MTL）抑肽酶抑肽
24、酶-EDTA神经降压素（神经降压素（NT）抑肽酶抑肽酶-EDTA神经肽（神经肽（NPY）抑肽酶抑肽酶-EDTA胃泌素胃泌素血清血清41四、骨代谢类四、骨代谢类骨钙素（骨钙素（BGP）血清血清降钙素（降钙素（CT）血清血清甲旁素相关肽甲旁素相关肽抑肽酶抑肽酶-EDTA五、甲状腺功能类五、甲状腺功能类游离游离T3游离游离T4甲状腺球蛋白甲状腺球蛋白TG总总T3总总T4 都为血清都为血清42六、肿瘤检测类六、肿瘤检测类甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（癌胚抗原（CEA）铁蛋白铁蛋白2微球蛋白微球蛋白七、糖尿病类七、糖尿病类胰岛素胰岛素 胰岛素抗体胰岛素抗体 胰高血糖素胰高血糖素C-肽肽 43八、八、吗啡、叶酸、维生素吗啡、叶酸、维生素 性激素类性激素类 44 45
