1、 基因治疗肿瘤的策略基因治疗肿瘤的策略 南通大学基础医学院南通大学基础医学院陈陈 莉莉 肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗肿瘤基因治疗已成为肿瘤生物治疗最引人瞩目的研究领域，是继手术、最引人瞩目的研究领域，是继手术、放疗、化疗、免疫治疗之后的第五种放疗、化疗、免疫治疗之后的第五种模式模式,是肿瘤治疗的有益补充。是肿瘤治疗的有益补充。基因治疗就是用正常或野生型基因校基因治疗就是用正常或野生型基因校正或置换致病基因的一种治疗方法。正或置换致病基因的一种治疗方法。基因治疗的基本程序：基因治疗的基本程序：1.目的基因准备；目的基因准备；2.受体细胞（靶细胞）培养；受体细胞（靶细胞）培养；3.载体的选择与克
2、隆；载体的选择与克隆；4.将目的基因导入靶细胞；将目的基因导入靶细胞；5.转导细胞的选择和鉴定；转导细胞的选择和鉴定；6.基因治疗的安全性鉴别及疗效评价基因治疗的安全性鉴别及疗效评价。基因治疗的主要措施有：基因治疗的主要措施有：1.基因置换基因置换（gene replacement）将致病基因整个的换以 正常基因，使致病基因永久的得到更正；2.基因修正基因修正（gene correction）将基因的突变碱基序列 纠正，而正常部分给予保留；3.基因修饰基因修饰（gene augmentation）将目的基因导入病变 细胞或其它细胞，目的基因的表达产物修饰改 变缺陷细胞的功能，或使原有的功能得到
3、增强；4.基因失活基因失活（gene inactivation）应用反义核苷酸或核酶特异 的封闭某些致病基因的表达；区别几个概念：区别几个概念：将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做将目的基因导入细胞或细菌，针对目的基因叫做转移（转移（transfer）针对宿主细胞叫做针对宿主细胞叫做转导（转导（transduction）而这一过程叫做而这一过程叫做转染（转染（transfection）目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫目的基因导入细胞导致宿主细胞的基因组分级至性状的改变叫做做转化（转化（transformation）第一节第一节 增强宿主抗肿瘤免疫增强宿主抗肿瘤免疫肿
4、瘤疫苗的作用肿瘤疫苗的作用 抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方抗肿瘤免疫有关的转基因治疗是肿瘤基因治疗的最初方案。为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要案。为增强机体免疫系统对肿瘤的识别，免疫基因治疗主要包括包括一、通过一、通过APC增强对肿瘤抗原的识别与呈递。增强对肿瘤抗原的识别与呈递。二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。二、增加肿瘤细胞表达细胞因子。三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子。三、增强肿瘤细胞表达的共刺激分子。一、以树突细胞为基础的肿瘤抗原免疫一、以树突细胞为基础的肿瘤抗原免疫 通过通过APC（Antigen Presenting Cells）增强对肿瘤）增强对肿瘤
5、抗原的识别与呈递。将编码目的抗原的基因，以重组抗原的识别与呈递。将编码目的抗原的基因，以重组表达载体的形式经各种基因转移途径转入机体细胞，表达载体的形式经各种基因转移途径转入机体细胞，借用宿主细胞的表达加工机构合成抗原分子。如通过借用宿主细胞的表达加工机构合成抗原分子。如通过主要组织相容性复合体（主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）和和/或或MHC类分子抗原处理和类分子抗原处理和输送途径将抗原信息呈递给输送途径将抗原信息呈递给T淋巴细胞，从而激发体淋巴细胞，从而激发体液免疫和细胞免疫。液免疫和细胞免疫。二、细胞因子的免疫基因治疗二、细
6、胞因子的免疫基因治疗 将将IL-1、IL-4、TNF、IFN等细胞因子基因导入肿等细胞因子基因导入肿瘤细胞，使瘤细胞表达出相应的抗原，随后激发瘤细胞，使瘤细胞表达出相应的抗原，随后激发CD4+毒性毒性T淋巴细胞淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)反应，而导致反应，而导致分泌肿瘤抗原的靶细胞溶解，以达到治疗肿瘤的目的。分泌肿瘤抗原的靶细胞溶解，以达到治疗肿瘤的目的。如如Shiau等在体内给予表达干扰素等在体内给予表达干扰素-的逆转录病毒进行的逆转录病毒进行鼠膀胱癌切除后的免疫基因治疗鼠膀胱癌切除后的免疫基因治疗,其目的是增加肿瘤细胞在其目的是增加肿瘤细胞在局部产生干扰
7、素局部产生干扰素-,以诱导淋巴细胞的反应达到治疗目的。以诱导淋巴细胞的反应达到治疗目的。这种能产生细胞因子的转基因瘤细胞具有肿瘤疫苗的作用，这种能产生细胞因子的转基因瘤细胞具有肿瘤疫苗的作用，这种肿瘤疫苗有替代无效的辅助性细胞（这种肿瘤疫苗有替代无效的辅助性细胞（Helper T Lymphocyte，TH）的作用，并对机体内远处的肿瘤具有）的作用，并对机体内远处的肿瘤具有抑制作用。抑制作用。将细胞因子基因导入肿瘤浸润的淋巴细胞（将细胞因子基因导入肿瘤浸润的淋巴细胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte，TIL）和淋巴因子激活的杀伤性）和淋巴因子激活的杀伤性细胞（细胞（L
8、ymphokine Activated Killer cell，LAK细胞），使细胞），使之活化，活化的之活化，活化的TIL具有显著抗自身肿瘤作用。回输体内具有显著抗自身肿瘤作用。回输体内后趋向于肿瘤局部聚集，并大量表达其携带能增强抗肿瘤后趋向于肿瘤局部聚集，并大量表达其携带能增强抗肿瘤免疫的细胞因子基因产物。免疫的细胞因子基因产物。Hull等比较了伴有等比较了伴有IL-12和共刺激分子和共刺激分子B7-1（AdmIL12/B7）两个载体表达的腺病毒和单纯伴有两个载体表达的腺病毒和单纯伴有IL-12/B7（AdmIL-12）表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的表达的腺病毒感染具有较差免疫原性的R
9、M-9鼠前列腺癌模鼠前列腺癌模型，研究发现在感染的型，研究发现在感染的RM-9鼠肿瘤细胞中鼠肿瘤细胞中AdmIL-12/B7能能介导介导IL-12分泌和增加分泌和增加B7-1在细胞表面的表达在细胞表面的表达,通过在比较通过在比较体内注射体内注射AdmIL-12/B7、AdmIL-12和对照组的疗效比较显和对照组的疗效比较显示前者能明显的减少肿瘤体积和增加鼠的存活率。使用两示前者能明显的减少肿瘤体积和增加鼠的存活率。使用两个载体的肿瘤治疗将滤过更多个载体的肿瘤治疗将滤过更多CD4+CD8+的免疫反应细胞。的免疫反应细胞。三、共刺激分子的作用三、共刺激分子的作用 将将MHC、类抗原基因导入肿瘤细胞
10、，使宿主类抗原基因导入肿瘤细胞，使宿主免疫系统识别肿瘤细胞为免疫系统识别肿瘤细胞为“异己异己”，以诱发抗肿瘤免疫，以诱发抗肿瘤免疫反应。可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精反应。可见基因免疫综合了减毒疫苗和亚单位疫苗的精髓，既象接种了活的病原体可以不断地表达抗原蛋白，髓，既象接种了活的病原体可以不断地表达抗原蛋白，又可以方便地精选所需基因片段，以激发理想的免疫反又可以方便地精选所需基因片段，以激发理想的免疫反应。应。Matubonis等研究的结果表明，某些肿瘤细胞等研究的结果表明，某些肿瘤细胞APC表面存在有共刺激分子表面存在有共刺激分子B7-16（CD80）表达时，更难有）表达时，更难
11、有效地激活效地激活CTL，基因疫苗激活的，基因疫苗激活的CTL具有高度的特异具有高度的特异性和性和MHC-I类分子限制性，其目的在于排除细胞外蛋类分子限制性，其目的在于排除细胞外蛋白与核酸的侵袭，这对防止杀伤作用的扩散及维持机体白与核酸的侵袭，这对防止杀伤作用的扩散及维持机体核酸物质的稳定具有重要意义核酸物质的稳定具有重要意义。应用这一手段前提是必须有肿瘤抗原的存在，应用这一手段前提是必须有肿瘤抗原的存在，特别是肿瘤特异性抗原，只有这样才可使诱导特别是肿瘤特异性抗原，只有这样才可使诱导的免疫反应只针对肿瘤而不破坏正常组织。以的免疫反应只针对肿瘤而不破坏正常组织。以往寻求肿瘤特异性抗原，先从寻找
12、癌基因开始，往寻求肿瘤特异性抗原，先从寻找癌基因开始，然后再从基因推导肽片断，近年来发展了一个然后再从基因推导肽片断，近年来发展了一个原来方法相反的研究路线，即原来方法相反的研究路线，即先分离可识别肿先分离可识别肿瘤特异性肽的瘤特异性肽的CTL，再通过，再通过CTL寻找其编码肽寻找其编码肽的基因。的基因。通过这种方法，发现了黑色素瘤基因通过这种方法，发现了黑色素瘤基因MAGE-1，其编码的抗原可为人类黑色素瘤的，其编码的抗原可为人类黑色素瘤的特异性特异性T细胞所识别。细胞所识别。Hu Xueyou等合成了等合成了MAGEAL九肽，负载自体九肽，负载自体APC后给病人免疫，发现可引起原位和远距离
13、部位的后给病人免疫，发现可引起原位和远距离部位的自体黑色素瘤反应和特异性自体黑色素瘤反应和特异性CTL数量增加，说明此法数量增加，说明此法可诱导肽特异性可诱导肽特异性CTL应答并进行循环。这一研究结果应答并进行循环。这一研究结果为特异性抗黑色素瘤的免疫治疗显示了良好的应用前为特异性抗黑色素瘤的免疫治疗显示了良好的应用前景。景。免疫基因治疗有助于克服抗癌治疗中碰到的肿瘤免疫基因治疗有助于克服抗癌治疗中碰到的肿瘤异质性、化疗耐受性、肿瘤细胞低免疫原性等困难。异质性、化疗耐受性、肿瘤细胞低免疫原性等困难。第二节第二节 恢复和增强抑癌基因的功能恢复和增强抑癌基因的功能引入抑癌基因引入抑癌基因 抑癌基因
14、是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要抑癌基因是抗肿瘤基因治疗中一类极为重要的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤的目的基因，将这类基因导入肿瘤细胞或非肿瘤细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代细胞，其表达产物通过复杂的基因调节或活化代谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌谢机制，能抑制肿瘤的恶性生长，甚至可导致癌细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参细胞逆转。虽然肿瘤的发生发展是一个多基因参与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌与、多步骤形成的过程，但在这些过程中某种癌基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性基因的激活或抑癌基因的失活可能起到了关键性的作用。的作用。用基因替代等
15、方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺用基因替代等方法恢复或增强抑癌基因杂合性的缺失，将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂失，将某些含有抑癌基因的染色体片断或整条染色体臂导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动导入那些已知或疑有抑癌基因缺失的肿瘤细胞或荷瘤动物体内，以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性，物体内，以消除肿瘤细胞的恶性表型和在体内致癌性，从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。从而达到控制肿瘤细胞异常生长的目的。基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研基因治疗和免疫的靶特异性分子治疗已进入临床研究阶段。如通过载有野生型究阶段。如通过载有野生型P53的腺病毒载体进行瘤体的
16、腺病毒载体进行瘤体内注射。这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗内注射。这种用病毒载体介导的转导肿瘤抑制基因治疗方法代表了癌症治疗的策略之一。用肿瘤抑制基因如方法代表了癌症治疗的策略之一。用肿瘤抑制基因如P53、Rb治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的。治疗因那些有这类基因突变的肿瘤是有价值的。体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有：体外转导抑癌基因对恶性肿瘤特征的影响有：转导转导WT、p53能使结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、能使结肠癌、骨肉瘤、神经胶质瘤、腺癌增殖降低；腺癌增殖降低；转导转导Rb基因能使视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、前列腺基因能使视网膜母细胞瘤、骨肉瘤、前列腺癌增殖降低；癌增殖
17、降低；转导转导wT-1能使裸鼠体内能使裸鼠体内wilms瘤形成下降；转导瘤形成下降；转导NF1能使神经纤维瘤病病灶减少；能使神经纤维瘤病病灶减少；增加增加p16基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少。基因能使裸鼠体内神经胶质瘤形成减少。在实体肿瘤中抑癌基因在实体肿瘤中抑癌基因P53分子对由化疗引分子对由化疗引起的起的DNA损伤有重要的作用损伤有重要的作用,可引起细胞周期停可引起细胞周期停滞与促使细胞凋亡，在食道癌研究中已获疗效。滞与促使细胞凋亡，在食道癌研究中已获疗效。自从自从1994年年Okamato等构建含有等构建含有p16INK4cDNA的表达载体的表达载体pCMV-p16，成功地转染，成功
18、地转染p16INK4基基因缺失的肺癌细胞系因缺失的肺癌细胞系Calu-6和卵巢癌细胞系和卵巢癌细胞系SKOV-3，抑制了瘤细胞株的集落形成率，并使，抑制了瘤细胞株的集落形成率，并使瘤细胞的继续生长得到控制。此后，在头颈部瘤细胞的继续生长得到控制。此后，在头颈部癌、卵巢癌中用腺病毒介导野生型癌、卵巢癌中用腺病毒介导野生型P53去消除去消除P53的突变，取得一定的疗效。的突变，取得一定的疗效。Nakamura等用野生型等用野生型P53肿瘤抑制基因替代肿瘤抑制基因替代疗法对结肠癌的治疗已在临床前期研究中获得成疗法对结肠癌的治疗已在临床前期研究中获得成功，还有待于临床阶段的进一步工作证明。功，还有待于
19、临床阶段的进一步工作证明。Schrump等对食管鳞状细胞癌系，等对食管鳞状细胞癌系，Fueyo、Higashi等分别对不同的神经胶质瘤细胞系进行等分别对不同的神经胶质瘤细胞系进行p16INK4基因替代治疗研究，证明基因替代治疗研究，证明p16INK4基因基因的替代治疗可以抑制肿瘤细胞的生长。进一步的的替代治疗可以抑制肿瘤细胞的生长。进一步的研究发现，这种抑制作用是有选择的，对研究发现，这种抑制作用是有选择的，对Rb基因基因缺失以及缺失以及p16INK4基因正常的肿瘤细胞无明显抑基因正常的肿瘤细胞无明显抑制作用。制作用。在研究中人们还发现在研究中人们还发现p16INK4基因正常的癌基因正常的癌细
20、胞株往往都有细胞株往往都有p53基因异常，基因异常，p53基因正常的基因正常的癌细胞株常有癌细胞株常有p16INK4基因变异，同时伴随基因变异，同时伴随cyclin D1的过度表达。因此，的过度表达。因此，p16INK4基因与其基因与其它基因联合治疗将能更好地抑制肿瘤。它基因联合治疗将能更好地抑制肿瘤。Sandig等用等用p53-p16重组病毒注射到患肝癌重组病毒注射到患肝癌的小鼠中，肿瘤生长出现逆转，提示了引入抑癌的小鼠中，肿瘤生长出现逆转，提示了引入抑癌基因在肿瘤治疗中的前景。基因在肿瘤治疗中的前景。第三节第三节 阻断癌基因功能阻断癌基因功能-反义核酸反义核酸RNA干扰技术干扰技术 细胞中
21、原癌基因的表达受到严格控制。细胞中原癌基因的表达受到严格控制。ras、myc、src这一类癌基因由于突变而使其功能处于这一类癌基因由于突变而使其功能处于异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞异常活跃状态，不断地激活细胞内正性调控细胞生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长。生长和增殖的信号传递通路，促使细胞异常生长。因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入因此基因治疗思路也可以将癌基因反义序列导入癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位癌细胞来拮抗癌基因；或引入非等位rev等方法，等方法，阻止癌基因功能。阻止癌基因功能。反义核酸技术的基本原理是根据核酸碱基反义核酸技术的基本原理是根据核酸碱基互
22、补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结互补配对的规律设计出能与靶基因特定区域结合的合的DNA或或RNA，以影响其靶基因的表达，抑，以影响其靶基因的表达，抑制其功能。制其功能。RNA干扰干扰(RNA interference,RNAi)是由双链是由双链RNA分子介导的序列特异性转录后基因沉默过分子介导的序列特异性转录后基因沉默过程，为双链程，为双链RNA分子在分子在mRNA水平上关闭相关水平上关闭相关基因表达的过程基因表达的过程,是一项新兴的基因阻断技术。是一项新兴的基因阻断技术。RNAi是一种转录后基因沉默是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene silenci
23、ng,PTGS)现象。现象。有关基因沉默现象最早的报道见于植物中。有关基因沉默现象最早的报道见于植物中。1995年年Gou等在对线虫的实验中发现等在对线虫的实验中发现,正义正义RNA与反与反义义RNA一样可以阻断一样可以阻断par-1基因的表达基因的表达,但作者对这一但作者对这一现象没有进行更深入的研究。现象没有进行更深入的研究。1998年年,Fire等首次将正义链和反义链的等首次将正义链和反义链的RNA结合物结合物双链双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)注入注入线虫线虫,结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要结果诱发了比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉
24、默强得多的基因沉默,每个细胞只要很少几个分子的双每个细胞只要很少几个分子的双链链RNA就足以完全阻断同源基因的表达。后续的实就足以完全阻断同源基因的表达。后续的实验还证实验还证实,在线虫体内注入双链在线虫体内注入双链RNA,不但可以阻断整不但可以阻断整个线虫的所有同源基因的表达个线虫的所有同源基因的表达,还会导致其第还会导致其第1代子代代子代的同源基因沉默的同源基因沉默,他们将这种现象命名为他们将这种现象命名为RNAi。此后。此后，在多种生物体内陆续发现了，在多种生物体内陆续发现了RNAi现象现象,许多学者认为许多学者认为,在生物中广泛存在的在生物中广泛存在的PTGS现象可视作不现象可视作不同
25、物种所共有的适应保护机制同物种所共有的适应保护机制:通过阻抑大量的异常通过阻抑大量的异常mRNA表达表达,抵抗转座子和病毒的侵袭抵抗转座子和病毒的侵袭,以保护机体免于受损以保护机体免于受损,相当于基因组的免疫系统；相当于基因组的免疫系统；通过调节编码蛋白基因的表达起到调控生命活动的作用。通过调节编码蛋白基因的表达起到调控生命活动的作用。RNAi在哺乳动物中的研究主要集中在干扰病毒在体内的在哺乳动物中的研究主要集中在干扰病毒在体内的复制、抑制癌基因表达及基因敲除后基因功能的研究等方复制、抑制癌基因表达及基因敲除后基因功能的研究等方面。面。与传统的基因研究方法与传统的基因研究方法基因敲除、定点突变
26、基因敲除、定点突变、反义核酸及核酶技术等相比、反义核酸及核酶技术等相比，RNAi具有以具有以下五大特点：下五大特点：基因序列特异性；基因序列特异性；dsRNA的稳定性；的稳定性；沉默信号传递性；沉默信号传递性；Knock-down高效性；高效性；RNAi效用浓度依赖性。效用浓度依赖性。一、一、RNAi的分子机制的分子机制 外源性外源性(如病毒如病毒)或内源性的或内源性的dsRNA 在细胞内与一种在细胞内与一种RNA 酶酶(RNAase 核酸内切酶核酸内切酶)Dicer 结合结合,随即被切割成随即被切割成2123nt 的带有的带有3端单链尾巴及磷酸化端单链尾巴及磷酸化5端的短链端的短链dsRNA
27、,即即小干扰小干扰RNA（small interfereing RNA,siRNA）。siRNA 与与Dicer 形成形成RNA引导沉默的复合体引导沉默的复合体(RNA induces silencing comple,RISC)。siRNA 作为引导序列作为引导序列,按照碱基互补原则识按照碱基互补原则识别靶基因转录出的别靶基因转录出的mRNA,并引导并引导RICS 结合结合mRNA。随后。随后siRNA与与mRNA 在复合体中换位在复合体中换位,核酸酶核酸酶Dicer 将将mRNA 切割切割成成2123nt 的片段的片段,特异性地抑制靶基因的表达。而新产生特异性地抑制靶基因的表达。而新产生的
28、的dsRNA 片段可再次形成片段可再次形成RISC,继续降解继续降解mRNA,从而产生从而产生级联放大效应。因此级联放大效应。因此,每个细胞只需要几个每个细胞只需要几个siRNA 分子就能分子就能够引起强烈的够引起强烈的RNAi 效应。此外效应。此外,siRNA 还可以在还可以在RNA 依赖依赖性性RNA 聚合酶聚合酶(RNA dependentRNA polymerase,RdRp)的的作用下进行大量扩增作用下进行大量扩增,并转运出细胞并转运出细胞,使使RNAi 扩散到整个机扩散到整个机体并可以传代。体并可以传代。阐明阐明siRNA在双链在双链RNA诱发的基因沉默中的作用是诱发的基因沉默中的
29、作用是RNA干干扰研究中最重要的发现之一。达到这一目的有几种途径：扰研究中最重要的发现之一。达到这一目的有几种途径：利用质粒载体或病毒载体转化或转染瘤细胞，在细胞内利用质粒载体或病毒载体转化或转染瘤细胞，在细胞内转录出能与目的基因正义转录出能与目的基因正义RNA相互补的反义相互补的反义RNA，从而，从而阻断目的基因蛋白质的表达。阻断目的基因蛋白质的表达。体外人工合成反义寡聚核苷酸。体外人工合成反义寡聚核苷酸。由于脱氧核苷酸的合成较容易，在体液中也比较稳定，而由于脱氧核苷酸的合成较容易，在体液中也比较稳定，而脱氧核苷酸也同样可以与脱氧核苷酸也同样可以与RNA相互配对结合，所以在实践相互配对结合，
30、所以在实践中多用反义核苷酸（中多用反义核苷酸（antisense oligodeoxyribonucleotide,AS-ODN）。）。与蛋白质水平相比，从遗传水平抑制基因表达能更有效地与蛋白质水平相比，从遗传水平抑制基因表达能更有效地阻断疾病的发生发展。阻断疾病的发生发展。二、二、RNAi在肿瘤治疗中的意义在肿瘤治疗中的意义 ras 基因包括基因包括K-ras、H-ras、N-ras,是鸟苷酸结合是鸟苷酸结合蛋白蛋白,对细胞的繁殖、分化和细胞生存起调控作用。对细胞的繁殖、分化和细胞生存起调控作用。ras 基因突变可使之处于长期激活基因突变可使之处于长期激活GTP 结合状态结合状态,易导致肿易
31、导致肿瘤的发生。瘤的发生。K-ras基因在人类肿瘤中最普遍活化状态的基因在人类肿瘤中最普遍活化状态的致癌基因，在肿瘤组织中的突变率致癌基因，在肿瘤组织中的突变率30-50%，在胰腺癌，在胰腺癌中高达中高达85%。突变的。突变的Ras基因与正常细胞中的野生型基因与正常细胞中的野生型ras基因通常只有一个碱基的不同，但由于基因通常只有一个碱基的不同，但由于RNAi的高度特的高度特异性，可以针对肿瘤细胞中突变的异性，可以针对肿瘤细胞中突变的ras基因产生抑制作基因产生抑制作用，而对正常细胞的野生型用，而对正常细胞的野生型ras不产生抑制作用。不产生抑制作用。最近最近Li-Mo Chen等报道建立等报
32、道建立K-rasV12突变基因的突变基因的siRNA腺病毒表达载体腺病毒表达载体,转染转染Panc-1胰腺癌细胞诱导凋亡、逆转胰腺癌细胞诱导凋亡、逆转肿瘤恶性表型。肿瘤恶性表型。Wei Wang等通过构建等通过构建K-ras基因的基因的siRNA 表达框架表达框架(siRNA expression cassette,SEC)成功抑制胰腺癌细胞株成功抑制胰腺癌细胞株MiaPaCa-2的的K-ras表达。表达。Fleming等报道，利用化学合成等报道，利用化学合成anti-K-ras-siRNA抑制了抑制了PANC-1和和MaiPaca-2胰腺癌细胞胰腺癌细胞K-ras的表达，并观测到的表达，并观
33、测到集落形成能力、细胞增殖能力和侵袭能力降低、凋亡增集落形成能力、细胞增殖能力和侵袭能力降低、凋亡增加，与加，与VEGF）和血小板反应素（）和血小板反应素（thrombspondin-1，TSP-1）基因和）基因和c-myc的下游调控元件、与肿瘤转移相关的下游调控元件、与肿瘤转移相关的葡萄糖转运蛋白的葡萄糖转运蛋白1（glucosue transporter，GLUT-1）基因表达变化。基因表达变化。癌胚抗原相关细胞黏附分子癌胚抗原相关细胞黏附分子6（CEARAM6）是免疫球）是免疫球蛋白超家族的成员，在许多肿瘤中都有表达，对肿瘤的蛋白超家族的成员，在许多肿瘤中都有表达，对肿瘤的形成、抵抗形成
34、、抵抗“失巢凋亡失巢凋亡”（anoikis：正常内皮细胞或表：正常内皮细胞或表皮细胞黏附不适宜的基质时引起细胞凋亡的一种现象）皮细胞黏附不适宜的基质时引起细胞凋亡的一种现象）和形成转移起到重要作用。和形成转移起到重要作用。Duxbury MS等通过化学合成等通过化学合成anti-CEARAM6-siRNA 抑抑制失巢凋亡高抵抗性制失巢凋亡高抵抗性MiaPaCa-2胰腺癌细胞株的胰腺癌细胞株的CEARAM6的表达，观察到失巢凋亡抵抗性的减弱以及的表达，观察到失巢凋亡抵抗性的减弱以及肿瘤细胞在体内、外模型中转移能力的降低。他们还分肿瘤细胞在体内、外模型中转移能力的降低。他们还分别利用逆转录病毒别利
35、用逆转录病毒siRNA表达载体和化学合成的方法介表达载体和化学合成的方法介导了对导了对CEARAM6基因高表达基因高表达BXPC3胰腺癌细胞株胰腺癌细胞株CEARAM6基因的敲减基因的敲减,观测到肿瘤细胞侵袭能力降低观测到肿瘤细胞侵袭能力降低、转移瘤生成能力下降，进一步证明了、转移瘤生成能力下降，进一步证明了CEARAM6基因基因在肿瘤形成、转移过程中起重要作用，为肿瘤的在肿瘤形成、转移过程中起重要作用，为肿瘤的RNAi治疗提供了作用靶点。治疗提供了作用靶点。BCR/ABL融合基因是定位于人融合基因是定位于人9q34上的上的C-ABL基因和基因和22q11上的上的BCR基因发生基因发生t(9:
36、22)易位，使相应无关的基因易位，使相应无关的基因发生融合而形成，它是发生融合而形成，它是PH染色体的分子基础，在染色体的分子基础，在CML发发病中起到重要作用。病中起到重要作用。Borkhardt等采用等采用RNAi技术成功地抑制了技术成功地抑制了K562白血病细白血病细胞中的胞中的BCR/ABL融合基因融合基因mRNA的表达，增加对的表达，增加对K562白白血病细胞凋亡的诱导作用，但在联合血病细胞凋亡的诱导作用，但在联合ABL酪氨酸抑制剂酪氨酸抑制剂-Imatinib治疗时，对细胞凋亡没有相加作用。治疗时，对细胞凋亡没有相加作用。RNAi技术的快速发展必将推动生物学和医学的大步前技术的快速
37、发展必将推动生物学和医学的大步前进。进。RNAi在医学领域的应用也必将为各种疾病尤其是在医学领域的应用也必将为各种疾病尤其是肿瘤等疾病的根治带来希望。但是肿瘤等疾病的根治带来希望。但是,从目前从目前RNAi的研究的研究现状来看现状来看,在哺乳动物中在哺乳动物中,RNAi并不能完全阻断基因的表并不能完全阻断基因的表达达,尤其是异常高表达的基因尤其是异常高表达的基因,这将促使人们去探索研究这将促使人们去探索研究新的更高效新的更高效siRNA表达载体体系。为了促进基于表达载体体系。为了促进基于RNAi的基因药物进入临床研究和应用的基因药物进入临床研究和应用,大量的研究已集中到大量的研究已集中到提高提
38、高siRNA分子的工业化生产能力、增加分子的工业化生产能力、增加siRNA分子稳分子稳定性、开发定性、开发siRNA药物的靶向传递系统等方面。尽管如药物的靶向传递系统等方面。尽管如此此,RNAi在癌症治疗中的应用已经取得非常大的成就在癌症治疗中的应用已经取得非常大的成就,因因此我们有理由相信此我们有理由相信RNAi必将对癌症的最终根治起到重必将对癌症的最终根治起到重要的作用。要的作用。第四节第四节 核酶用于基因治疗核酶用于基因治疗 1983年美国Cech和Altmann发现并鉴定了一类具有酶催化作用的核苷酸片断，称为核酶(Ribozyme)。这一发现使酶的概念从蛋白领域扩展到核酸领域。核酶具有
39、核苷酸内切酶的活性，它能在无核酶具有核苷酸内切酶的活性，它能在无蛋白质的条件下切割靶蛋白质的条件下切割靶RNA分子分子。核酶用于基因治疗的条件是核酶用于基因治疗的条件是 找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质；找出肿瘤发生发展中关键性的蛋白质；这种蛋白的氨基酸序列（和编码基因序这种蛋白的氨基酸序列（和编码基因序 列）必须是已知的，以便设计核酶的切列）必须是已知的，以便设计核酶的切 割位点；割位点；所设计的核酶必须能够切割靶所设计的核酶必须能够切割靶RNA；肿瘤细胞必须能摄取这种核酶，肿瘤细胞必须能摄取这种核酶，并能在细胞内切割靶并能在细胞内切割靶RNA。反义治疗并不像刚开始人们所想像反义治疗并不像刚
40、开始人们所想像的那么简单，目前还有许多关键性问题的那么简单，目前还有许多关键性问题有待去解决，如生物学稳定性，药物的有待去解决，如生物学稳定性，药物的释放系统，以及由序列特异性和非特异释放系统，以及由序列特异性和非特异性所引起的作用包括毒副作用等。应用性所引起的作用包括毒副作用等。应用反义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶反义技术进行肿瘤基因治疗最常用的靶基因有基因有Ha-ras、c-myc、c-fos、c-jum、c-erbB2等癌基因以及编码端粒酶基因，等癌基因以及编码端粒酶基因，或端粒酶的或端粒酶的RNA部分。部分。第五节第五节 抗肿瘤血管生成的基因治疗抗肿瘤血管生成的基因治疗 肿瘤的生长、
41、转移与新生血管的形成密切相肿瘤的生长、转移与新生血管的形成密切相关关,由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子、血管由于肿瘤的血管生成受到血管生长因子、血管生长抑制因子以及其它的因子的共同调控生长抑制因子以及其它的因子的共同调控,因此通因此通过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑过阻断促血管生长因子作用或者强化血管生长抑制因子的表达均可达到治疗的目的。制因子的表达均可达到治疗的目的。一、阻断血管生长因子的作用一、阻断血管生长因子的作用 主要是采用反义主要是采用反义DNA、中和性抗体、受体酪、中和性抗体、受体酪氨酸激酶的抑制剂以及核酶等。氨酸激酶的抑制剂以及核酶等。用腺病毒载体介导的用腺病毒载体介
42、导的VEGF 的拮抗物输入鼠卵巢的拮抗物输入鼠卵巢癌抑制癌抑制VEGF 的活性的活性；利用含有利用含有VEGF cDNA 的腺病毒载体转染乳腺癌的腺病毒载体转染乳腺癌细胞细胞,用以拮抗用以拮抗VEGF 的促血管生成作用的促血管生成作用；用抗用抗VEGF 的核酶抑制的核酶抑制VEGF 的表达的表达,使卵巢癌使卵巢癌生长及血管生成减少的报告。生长及血管生成减少的报告。针对其它的血管生成因子的治疗针对其它的血管生成因子的治疗,如如bFGF,缺氧缺氧诱导因子诱导因子(HIF),EGF,PDGF,PDECGF,IGF,Ets-1,HGF 等的因子的治疗。等的因子的治疗。Zhang等用等用VEGF siR
43、NA特异性地抑制特异性地抑制VEGF的表达的表达,成功地抑制小鼠卵巢癌上皮成功地抑制小鼠卵巢癌上皮ID8细胞的增殖。细胞的增殖。TSP1是一种是一种血管抑制因子血管抑制因子,它可以抑制它可以抑制mmp9基因的激活基因的激活,从而抑制肿瘤从而抑制肿瘤的生长。一般说来的生长。一般说来,肿瘤细胞能够通过抑制肿瘤细胞能够通过抑制TSP1的表达来的表达来达到其指数增殖的目的。通常情况下达到其指数增殖的目的。通常情况下,VEGF能够抵制能够抵制TSP1的血管生长抑制作用。的血管生长抑制作用。Filleur等用等用VEGF siRNA转染肿瘤转染肿瘤细胞细胞,发现发现VEGF siRNA抑制效应可以与分泌抑
44、制效应可以与分泌TSP1的肿瘤细的肿瘤细胞协同作用胞协同作用,抑制肿瘤的生长抑制肿瘤的生长,并且并且VEGF siRNA能阻止能阻止TSP1耐受细胞的出现耐受细胞的出现,并极大地抑制了这些细胞的生长速并极大地抑制了这些细胞的生长速度。度。二、上调血管生长抑制因子二、上调血管生长抑制因子 用重组血管抑素用重组血管抑素cDNA 输入消化道肿瘤输入消化道肿瘤可取得较好的治疗效果可取得较好的治疗效果,用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制用编码内皮抑素的重组腺病毒载体可抑制内皮细胞迁移和内皮细胞迁移和VEGF 介导的血管生成介导的血管生成,病毒载体介导的重组编码病毒载体介导的重组编码PF4 的反义基因的
45、反义基因显示出抗鳞癌血管生长的作用。显示出抗鳞癌血管生长的作用。三、抑制细胞外基质和基膜降解以及抑制内皮三、抑制细胞外基质和基膜降解以及抑制内皮细胞特异性粘附分子的作用细胞特异性粘附分子的作用 用腺病毒载体介导的用腺病毒载体介导的T1MP-1 基因转染肿基因转染肿瘤细胞瘤细胞,瘤细胞产生的瘤细胞产生的T1MP-1 抑制了抑制了MMP-2,MMP-9 的活性的活性,使内皮细胞的迁移受到抑制。使内皮细胞的迁移受到抑制。Gondi 等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的等采用双顺反子逆转录病毒载体介导的反义反义uPAR 和和uPA 治疗胶质瘤治疗胶质瘤,明显抑制了肿瘤明显抑制了肿瘤的血管生成。的血管生成
46、。第五节第五节、加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别、加大肿瘤细胞与正常细胞的天然差别 自杀基因治疗自杀基因治疗自杀基因（自杀基因（suicide gene）治疗思路就是人为地）治疗思路就是人为地改变肿瘤细胞的状态，将一些改变肿瘤细胞的状态，将一些“自杀基自杀基因因”(TK基因、基因、CD基因和较新的细胞色素基因和较新的细胞色素p450-2B1基因基因)转导入肿瘤细胞中，这些基因所转导入肿瘤细胞中，这些基因所表达的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的表达的产物能将原先对细胞无毒或相对低毒的物质转变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞物质转变为细胞毒性物质，而引起到杀伤细胞的作用。的作用。一、旁观者效应与
47、机制一、旁观者效应与机制1、旁观者效应、旁观者效应(bystander effect)几乎所有的自杀基因系统都具有旁杀伤效应，即不仅转导自杀几乎所有的自杀基因系统都具有旁杀伤效应，即不仅转导自杀基因的细胞可以被杀死，而且与其相邻的未转导自杀基因的细基因的细胞可以被杀死，而且与其相邻的未转导自杀基因的细胞亦可被杀死。研究发现旁杀伤效应一般是胞亦可被杀死。研究发现旁杀伤效应一般是1：10，即一个基因，即一个基因修饰细胞死亡时带动修饰细胞死亡时带动10个基因未修饰细胞死亡，由此可见个基因未修饰细胞死亡，由此可见“旁旁观者效应观者效应”明显扩大了自杀基因的杀伤作用。明显扩大了自杀基因的杀伤作用。2、旁
48、观者效应的可能机制、旁观者效应的可能机制 磷酸化的巯基通过缝隙连接在同类细胞间传递；磷酸化的巯基通过缝隙连接在同类细胞间传递；自杀基因自杀基因（TK-GCV）介导的细胞死亡表现为凋亡，临近未介导的细胞死亡表现为凋亡，临近未转染细胞吞噬凋亡小体，而凋亡小体内含有转染细胞吞噬凋亡小体，而凋亡小体内含有GCV三磷酸代谢产三磷酸代谢产物；物；自杀基因可使肿瘤从免疫抑制转变为免疫刺激，包括各种细自杀基因可使肿瘤从免疫抑制转变为免疫刺激，包括各种细胞因子释放和免疫细胞浸润的级联反应；胞因子释放和免疫细胞浸润的级联反应；死亡细胞中抗原暴露，被周围死亡细胞中抗原暴露，被周围APC摄取而产生抗肿瘤免疫。摄取而产
49、生抗肿瘤免疫。二、靶向基因表达和治疗二、靶向基因表达和治疗 应用自杀基因进行基因治疗时，首先要求转染的自应用自杀基因进行基因治疗时，首先要求转染的自杀基因要有一定的表达效率。其次，导入的基因要局限杀基因要有一定的表达效率。其次，导入的基因要局限于靶细胞，常用的病毒载体导入法能较好地解决这个问于靶细胞，常用的病毒载体导入法能较好地解决这个问题。增加病毒载体靶向性的一种重要策略就是利用肿瘤题。增加病毒载体靶向性的一种重要策略就是利用肿瘤特异性调控元件去调节自杀基因的表达。肿瘤细胞内具特异性调控元件去调节自杀基因的表达。肿瘤细胞内具有特异性转录激活因子，能激活特定蛋白的转录表达，有特异性转录激活因子
50、，能激活特定蛋白的转录表达，而转录激活的作用是通过结构基因上游的特异性调控序而转录激活的作用是通过结构基因上游的特异性调控序列起作用，正常细胞内无此类特定的转录激活因子。因列起作用，正常细胞内无此类特定的转录激活因子。因此，当正常细胞和肿瘤细胞都被转染特异调控序列控制此，当正常细胞和肿瘤细胞都被转染特异调控序列控制的外源性目的基因后，肿瘤细胞内的特异性调控序列可的外源性目的基因后，肿瘤细胞内的特异性调控序列可被激活，表达目的基因，从而达到靶向基因表达和治疗被激活，表达目的基因，从而达到靶向基因表达和治疗的目的，正常细胞则不能表达。的目的，正常细胞则不能表达。在各种调控序列中，组织特异性启动子常
