1、疯牛病及其检测规范疯牛病及其检测规范刘雨田刘雨田国家牛海绵状脑病参考实验室国家牛海绵状脑病参考实验室中国动物卫生与流行病学中心中国动物卫生与流行病学中心2008年年5月月两个参考实验室：两个参考实验室：国家新城疫参考实验室 国家疯牛病参考实验室外来病：外来病：小反刍兽疫、尼帕病、西尼罗河热、裂谷热、水泡性口炎、羊痒病、疯牛病、结节性皮肤病、C型口蹄疫 等国家外来动物疫病诊断中心国家外来动物疫病诊断中心一、疯牛病的历史一、疯牛病的历史n1986年首次在英国确诊n1988年基本摸清疯牛病的发病原因和流行情况n1990年我国农业部发出严防疯牛病传入我国的通知n1992年和1993年疯牛病发病率达到高
2、峰n1996年确诊第一例人疯牛病（nvCJD）n2001年疯牛病首次在亚洲的日本发生n2003年疯牛病首次在北美的加拿大发生n2005年疯牛病首次在北美的美国发生n2008年，疯牛病还在发生，只是数量不多 二、定义二、定义 疯牛病疯牛病（BSE），），学名为学名为牛海绵状脑病，是成年牛的牛海绵状脑病，是成年牛的一种致死性渐进性神经性疾一种致死性渐进性神经性疾病。它是一个新病，也是第病。它是一个新病，也是第一个人造动物病。它与人的一个人造动物病。它与人的克雅氏病克雅氏病（CJD）、）、库鲁病库鲁病（Kuru）以及以及绵羊痒病绵羊痒病（Scrapie）等统称为等统称为传染性海绵状脑传染性海绵状脑病
3、病（TSE）。）。三、BSE病原朊毒体 （PrPSc）n源于肉骨粉中的痒病因子n一种奇特的蛋白质Prion，宿主神经元表面正常朊蛋白的异构体n感染动物不会产生免疫应答反应n能抵抗PK酶的消化n很难灭活n无株系差异（？）正常正常异常异常 PKPK消化消化 溶于溶于DD DD 螺旋螺旋 折叠折叠 PrPPrPC C 是是是是 40%40%约约3%3%PrPPrPScSc 否否 否否 30%45%30%45%PrPPrPScSc对一般的物理化学消毒方法具有极强的抵抗力对一般的物理化学消毒方法具有极强的抵抗力 最有效的杀灭方法是焚烧；最有效的杀灭方法是焚烧；134-138134-138蒸汽高压消毒蒸汽
4、高压消毒，1818分钟；此外，含有效氯的次氯酸钠及的分钟；此外，含有效氯的次氯酸钠及的氢氧化钠，氢氧化钠，2020o oC C、1 1小时以上用于表面消毒小时以上用于表面消毒免疫学免疫学检测的检测的基础基础 、潜伏期、潜伏期2 2年或更长，平均为年或更长，平均为3 3年年、发病率、发病率感染牛群的发病率在感染牛群的发病率在3%3%以下以下、感染来源、感染来源痒病病羊或痒病病羊或BSEBSE病牛，制成的肉骨粉病牛，制成的肉骨粉(MBM)(MBM)、传播途径传播途径主要通过饲料传播主要通过饲料传播，无水平传播和垂直传播的证据，无水平传播和垂直传播的证据，但在疫病防控中要考虑但在疫病防控中要考虑四、
5、流行病学四、流行病学PrPScPrPScPrPScPrPScnvCJD有机溶剂有机溶剂&134少量少量PrPSc、易感动物、易感动物 ）牛科动物）牛科动物家牛、野牛等家牛、野牛等与痒病不同，无遗传易感性的差异与痒病不同，无遗传易感性的差异奶牛多发，因奶牛存养时间比肉牛长奶牛多发，因奶牛存养时间比肉牛长）猫科）猫科家猫、虎、豹、狮等家猫、虎、豹、狮等）实验感染）实验感染牛、猪、绵羊、山羊、鼠、貂、猴牛、猪、绵羊、山羊、鼠、貂、猴 鸡不发病鸡不发病、BSE BSE 发生流行的三个要素发生流行的三个要素 ）存在大量绵羊且有痒病流行或从）存在大量绵羊且有痒病流行或从 痒病、痒病、BSEBSE发病国进口
6、了污染朊毒体的发病国进口了污染朊毒体的 动物组织或肉骨粉动物组织或肉骨粉 ）肉骨粉加工方法不能灭活朊毒体）肉骨粉加工方法不能灭活朊毒体 ）用这种肉骨粉喂牛）用这种肉骨粉喂牛国外某肉骨粉加工厂国外某肉骨粉加工厂我国某骨粉加工厂我国某骨粉加工厂7 7、病例分布、病例分布n英国（97%）n欧洲其他大部分国家n亚洲日本、以色利n北美洲加拿大、美国n中国？我国从BSE发病国进口肉骨粉的情况(吨)荷 兰英 国日 本1996年至2001年去向不明去向不明1989年至2007年各国BSE发病总数情况1989年至2007年各国BSE发病总数情况0200004000060000800001000001200001
7、40000160000180000200000AusBelCanCzeDenFinFraGerGreIreIsrItaJapLieLuxNethPolPorSloSlveSpaiSweSwitUKUSA 国家国家97%BSE 25国国五、发病机理五、发病机理回肠陪氏淋巴结回肠陪氏淋巴结口服口服DC中复制中复制 （1）脾脾DC中复制中复制 （2）肠神经丛肠神经丛腹腔注射腹腔注射中枢神经中枢神经迷走神经迷走神经?SOD活性下降活性下降抗氧化功能降低抗氧化功能降低海绵状脑部病变海绵状脑部病变 神经症状神经症状六、病原在机体内的分布六、病原在机体内的分布(SRM)外周神经？七、公共卫生1、食物：、食物
8、：污染污染BSE病原的食品；病原的食品；2、医源性：、医源性：手术、牛源性医疗器械、手术、牛源性医疗器械、药品；药品；3、化妆品：、化妆品：口红（污染口红（污染BSE）；）；八、其他影响八、其他影响n经济方面经济方面 英国：超过百亿英镑；美国：英国：超过百亿英镑；美国：60亿美元；加亿美元；加拿大：拿大：40亿美元。亿美元。n社会方面社会方面 恐慌，不肯吃肉牛等恐慌，不肯吃肉牛等n政治方面政治方面 英国农业部部长下台、德国农业部和卫生部英国农业部部长下台、德国农业部和卫生部部长下台、日本农水省官员受处分。部长下台、日本农水省官员受处分。BSE成为政治问题成为政治问题贸易谈判贸易谈判九、国际九、
9、国际BSEBSE有关情况介绍有关情况介绍n发达国家的发达国家的BSEBSE检测数量惊人检测数量惊人nOIEOIE正在推进正在推进BSEBSE风险等级认证：检测数量风险等级认证：检测数量要换算成监测分数值要换算成监测分数值Table 1.Points targets for different adult cattle population sizesin a country,zone or compartment Points targets for country,zone or compartmentAdult cattle population size(24 months and ol
10、der)（头）Type A surveillanceType B surveillance1,000,000300,000150,000800,000-1,000,000240,000120,000600,000-800,000180,00090,000400,000-600,000120,00060,000200,000-400,00060,00030,000100,000-200,00030,00015,00050,000-100,00015,0007,500（分数值）（分数值）Table 2.Surveillance point values for samples collectedf
11、rom animals in the given subpopulation and age categorySurveillance subpopulationRoutineslaughter2.Fallenstock3.Casualtyslaughter4.Clinicalsuspect5.Age 1 year and 2 years and 4 years and 7 years and 9 years(aged)0.00.10.245（不同亚群与年龄段的分数值）十、我国BSE 检测规范 、临床诊断、临床诊断 、鉴别诊断、鉴别诊断 、实验室诊断、实验室诊断 1、临床诊断发病初期非常隐蔽，
12、不易察非常隐蔽，不易察觉。觉。主要表现为走路落主要表现为走路落伍、不愿过水泥地伍、不愿过水泥地和门槛、挤奶时踢和门槛、挤奶时踢腿、反刍减少、走腿、反刍减少、走路时高抬后腿、逐路时高抬后腿、逐渐消瘦。渐消瘦。发病后期 食欲不振、明显消瘦、行走时左右摇摆、易倒地并且起来困难、怕光、怕触摸、怕刺耳的声音、经常甩头、具有明显的攻击性、时有瘙痒、颤抖、踢腿明显、神经症状明显、不愿过障碍物 2 2、鉴别诊断、鉴别诊断 ）有机磷农药中毒有机磷农药中毒）低镁血症低镁血症）神经性酮病神经性酮病）李氏杆菌病李氏杆菌病）脑灰质软化或脑皮质坏死脑灰质软化或脑皮质坏死）脑内肿瘤脑内肿瘤）脑内寄生虫病脑内寄生虫病）狂犬病
13、狂犬病 9）其他脑病其他脑病3 3、实验室诊断、实验室诊断 1 1）组织病理染色法（）组织病理染色法（HEHE染色）染色）方法确实，方法确实，80-90%80-90%，经验，经验 2 2）免疫组化）免疫组化检查检查PrPPrPScSc，确诊，确诊，OIEOIE规定的规定的“金标准金标准”3 3）Western-blottingWestern-blotting检查检查PrPPrPScSc，辅助确诊，昂贵，辅助确诊，昂贵 4 4）ELISAELISA筛检方法，简便快速、价格昂贵筛检方法，简便快速、价格昂贵 5 5）动物接种实验）动物接种实验 脑内接种转基因鼠，脑内接种转基因鼠，7070天左右潜伏期
14、天左右潜伏期临床表现 临床可疑临床可疑、紧急屠宰、紧急屠宰、病死牛病死牛年龄 4-7岁为主品种 奶牛为主，肉牛为辅尽量在奶牛场采样样品要求n临床可疑牛：临床可疑牛：n1一般可疑：一般可疑：行为改变，如落伍 像拉马车样低头站立 过度舔舌 n经常伸展脖子 耳朵竖立 失明 磨牙 n2中度可疑：中度可疑：没有外伤或感染而濒临死亡 斜靠着物体才能站立 n瘫痪/局部麻痹 颤抖 走路时后肢过度摇摆 意识异常 转圈运动 倒地 踢腿 兴奋 狂怒 胆怯 恐惧 共济失调 n3高度可疑：高度可疑：感觉过敏如听觉、触觉、视觉 面对舍门或障碍物犹豫不前 不愿进挤奶室 挤奶时持续踢踏 走路时后肢过度伸展 n紧急屠宰牛：紧急
15、屠宰牛：n倒地不起 不愿行动 严重伤病 宰前检验认为要销毁的牛 其他 n死畜：死畜：n在农场病死的 在运输过程中病死的 在其他地方病死的 第一对恒齿长齐24月龄与30月龄之间乳齿-小于24月龄三颗恒齿-30月龄两对恒齿-大于30月龄永久门齿生长情况永久门齿生长情况对应年龄对应年龄第一对永久门齿长出2岁第二对永久门齿长出3岁第三对永久门齿长出4岁第四对永久门齿长出(齐口)5岁前三对永久门齿齿面重磨，第四对永久齿也出现磨损6岁第一对永久门齿齿面呈方形7-8岁第二对永久门齿齿面呈方形8-9岁第一对永久门齿齿面呈圆形，第三对永久门齿齿面呈方形9-10岁第一对永久门齿齿面呈三角形，第四对永久门齿齿面呈方
16、形11岁第二、三、四对永久门齿齿面呈三角形采集牛脑采样勺法物品准备：物品准备：采样单、采样单、手套、手套、剪刀、口罩、工剪刀、口罩、工作服、样品杯、作服、样品杯、记号笔或铅笔、记号笔或铅笔、冰袋、大号透明冰袋、大号透明胶带、带盖泡沫胶带、带盖泡沫箱、签字笔或圆箱、签字笔或圆珠笔、吸水纸珠笔、吸水纸 脑硬膜脑硬膜延脑延脑冷冻样品先以ELISA方法筛检，然后确诊用IHC方法采集牛脑电锯法电锯法甲醛固定的全脑只能以IHC方法和HE染色检测Obex采样存在的问题采样存在的问题n健康牛的比例太大健康牛的比例太大n采集部位不对采集部位不对n采样单填写不详细采样单填写不详细n样品冷冻程度不够样品冷冻程度不够
17、实验室检测实验室检测组织病理学方法组织病理学方法(HE)(HE)常规的HE染色 耗时较长，从组织固定到观察结果至少10天 结果判断较难，要丰富的经验 确诊率不高，需要结合其他免疫学方法 观察空泡变化，有时没有典型的空泡病变-神经元和神经纤维网浆 常用的仪器设备 简单但耗时，价格低廉简明步骤取材透明甲醛固定脱甲醛脱水浸蜡包埋切片烤片脱蜡苏木精染色伊红染色透明封片观察结果免疫组织化学方法(IHC)核心技术：单抗 OIE规定为“金标准”确诊方法 从组织固定到结果判断耗时至少10天 参考实验室必须熟练掌握的技术 常用的仪器设备 工作量大 方法简单但耗时，价格低廉，操作要仔细简明步骤取材透明甲醛固定脱甲
18、醛脱水浸蜡包埋切片烤片脱蜡PK酶消化封闭单抗孵育ABC试剂孵育观察结果封片（1为孤束核疯牛病，2为三叉神经第五束核，3为迷走神经背核痒病）HEHE染色染色HEHE染色染色IHCIHC染色染色IHCIHC染色染色空泡空泡空泡空泡紫红色颗粒紫红色颗粒紫红色颗粒紫红色颗粒ELISA方法 商品化的试剂盒，通过欧盟认证 各种产品的检测原理基本一致 结果准确，快速，价格贵 筛检方法，确诊时需结合免疫组化或免疫印迹方法 IDEXX BSE EIA 免疫印迹方法(WB)商品化的试剂盒，通过欧盟认证 也可以自己建立稳定的WB方法 检测原理 结果准确，快速，价格贵 确诊方法 简明步骤n灌胶n样品处理 n电泳 n电转移 n化学发光检测 n分析结果 十一、防范十一、防范内查外堵BSE和痒病监测、强制报告、风险和痒病监测、强制报告、风险分析评估、分析评估、饲料监管饲料监管禁止进口来源于禁止进口来源于BSE和痒病发和痒病发生国的活牛羊及其相关产品生国的活牛羊及其相关产品宣传通告报刊杂志报刊杂志电台、网络、培训、会议电台、网络、培训、会议（一类动物疫病）（一类动物疫病）农业部、卫生部、海关总署、农业部、卫生部、海关总署、国国家质量监督检验检疫总局家质量监督检验检疫总局、国家国家食品药品监督管理局食品药品监督管理局、国家出入国家出入境检验检疫局境检验检疫局等（三十多个法规）等（三十多个法规）
