1、细胞超微结构与电镜技术细胞超微结构与电镜技术1.绪论绪论-电子显微镜与医学发展电子显微镜与医学发展 张志刚 复旦大学基础医学院电镜室中世纪以前中世纪以前推测医学推测医学16-18世纪器官病理学18世纪细胞病理学20世纪超微病理分子病理1931年年 电镜电镜1665年年 光镜光镜新世纪新世纪冷冻电子显微技术冷冻电子显微技术现代分现代分子医学子医学v1.器官病理学器官病理学(organ pathology)Benivieni 报道了报道了15例典型的尸检病例例典型的尸检病例 Morgagni 1761年报道了年报道了700多例尸检，多例尸检，并发表了并发表了“疾病的部位和原因疾病的部位和原因”一书
2、一书 Rokitansky-一生做了一生做了3万多例解剖万多例解剖v2.细胞病理学（细胞病理学（cellular pathology）伦勃朗蒂尔普医生的解剖课Schleiden&Schwan（1804，1810）植物和动物由细胞组成植物和动物由细胞组成 结论：结论：“一切有机体均由细胞组成一切有机体均由细胞组成”Virchow(德国人德国人):1858年写成了年写成了“cellular pathology”“对疾病的认识提高了对疾病的认识提高了300倍倍”3.超微病理学、分子病理学超微病理学、分子病理学 (Ultrastructure and molecular pathology)电镜问世电
3、镜问世 20 20世纪世纪3030年代，年代，超薄切片技术超薄切片技术 20 20世纪世纪5050年代，年代，分子生物学技术分子生物学技术 20 20世纪世纪7070年代。年代。现代病理学把细胞、器官、及分子生物学研究结合起来把形态研究与现代病理学把细胞、器官、及分子生物学研究结合起来把形态研究与功能研究结合起来，功能研究结合起来，大大加深入对许多疾病的复杂病理过程及其发病机制的认识，大大加深入对许多疾病的复杂病理过程及其发病机制的认识，为为诊治疾病提供更加重要而又扎实的基础。诊治疾病提供更加重要而又扎实的基础。v2.细胞学和细胞病理学细胞学和细胞病理学 第一阶段：第一阶段：从16世纪后期到1
4、9世纪30年代，是细胞发现和细胞知识的积累阶段。通过对大量动植物的观察，人们逐渐意识到不同的生物都是由形形色色的细胞构成的。在科学史上具有深远意义事件是显微镜的发明 1590年荷兰有一位眼镜师的儿子名叫江生的少年,他无意中把两片大小不同的凸透镜重叠在一起,当移动至适当的距离时,突然发现很小的东西一下子被放大了好多倍.这一不寻常的发现使,世界上最早的显微镜诞生了.1665年,英国学者物理学家虎克(Robert Hooke)设计制造了首架光学显微镜由上下两块透镜组成的复合显微镜,当时放大倍数为40140倍,并用此首次观察并描述了植物细胞,胡克用这架显微镜第一次发现了细胞,“cell”一词即为他所定
5、名,一直沿用至今.今天 我们可以在英国伦敦科学博物馆看到这架显 微镜.。同年发表显微图谱一书。v2.细胞病理学（细胞病理学（cellular pathology）Virchow(魏尔箫魏尔箫,德国病理学家德国病理学家):1858年写成了年写成了“cellular pathology”“对疾病的认对疾病的认识提高了识提高了300倍倍”第二阶段：第二阶段：从19世纪30年代到20世纪初期，细胞学说形成后，开辟了一个新的研究领域，在显微水平研究细胞的结构与功能是这一时期的主要特点。形态学、胚胎学和染色体知识的积累，使人们认识了细胞在生命活动中的重要作用。1893年Hertwig的专著细胞与组织（Di
6、e Zelle und die Gewebe）出版，标志着细胞学的诞生。其后1896年哥伦比亚大学Wilson编著的The Cell in Development and Heredity、1920年墨尔本大学Agar编著的Cytology 都是这一领域最早的教科书。u3.超微病理学超微病理学 (Ultrastructure pathology)电镜问世电镜问世 20 20世纪世纪3030年代年代 超薄切片技术超薄切片技术 20 20世纪世纪5050年代年代1932 德国人E.A.F.Ruska描述了一台最初的电子显微镜，1940年美国和德国制造出分辨力为0.2nm的商品电镜。1931年，一束
7、轻盈的电子在一条一米多高的巨型金属柱中加速（见下图），继而被汇聚在一些小网格样品上，将小格放大了14.4倍。这台试验品就被定义为“世上第一台电子显微镜”（电镜），尽管放大本领和一把手持放大镜差不多，但它却标志人类首次以电代光“照”出了物体的影像。执行这项工程的德国科学家卢斯卡也因此在55年后被颁予诺贝尔奖。电镜诞生后，电子被不断提速，其波长越来越短，能照出的细节也越来越精致10年之内，电镜的理论分辨率已达10纳米（当然那时没有真正实现），是细胞膜的厚度。二透射电子显微镜的发展历程二透射电子显微镜的发展历程 1924年，德国科学家德布罗意(De Broglie)指出，任何一种接近光速运动的粒子都
8、具有波动本质。然后进一步证明了电子的波动性，发现电子波长比X光还要短，从而联想到可用电子射线代替可见光照明样品来制作电子显微镜，以克服光波长在分辨率上的局限性。1931年，德国学者诺尔(Knoll)和鲁斯卡(Ruska)获得了放大1217倍的电子光学系统中的光阑的像，证明可用电子束和电磁透镜得到电子像，但是这一装置还不是真正的电子显微镜，因为它没有样品台。19311933年间，鲁斯卡等对以上装置进行了改进，做出了世界上第一台透射电子显微镜（简称透射电镜）。1934年，电子显微镜的分辨率已达到500，鲁斯卡也因此获得了1986年的诺贝尔物理学奖。1939年德国西门子公司造出了世界第一台商品透射电
9、子显微镜，分辨率优于100.1954年又产生了著名的西门子Elmiskop型电子显微镜，分辨率优于10.在英国，透射电子显微镜的研究始于1935年，1946年设计了第一批商业透射电子显微镜，导致了EM型电镜的系列生产。1944年荷兰研制成第一台电镜，后来生产了著名的Philips EM和CM型透射电子显微镜。我国的透射电子显微镜研制始于20世纪50年代，1977年已作出了分辨率为3的80万倍的透射电镜。目前世界上生产透射电镜的主要是这三家电镜制造商：日本的日本电子(JEOL)和日立(Hitachi)以及美国的FEI（这家公司把荷兰的菲利浦电镜公司收购了）。第三阶段：第三阶段：从20世纪30年代
10、到70年代，电子显微镜技术出现后，把细胞学带入了第三大发展时期，这短短40年间不仅发现了细胞的各类超微结构，而且也认识了细胞膜、线粒体、叶绿体等不同结构的功能，使细胞学发展为细胞生物学。De Robertis等人1924出版的普通细胞学（General Cytology）在1965年第四版的时候定名为细胞生物学（Cell Biology），这是最早的细胞生物学教材之一。第四阶段：第四阶段：从20世纪70年代基因重组技术的出现到当前，细胞生物学与分子生物学的结合愈来愈紧密，研究细胞的分子结构及其在生命活动中的作用成为主要任务，基因调控、信号转导、肿瘤生物学、细胞分化和凋亡是当代的研究热点。u3.
11、超微病理学、分子病理学超微病理学、分子病理学 (molecular pathology)嗜铬细胞瘤-分泌颗粒急性肾炎-驼峰膜性肾炎膜性肾炎电子致密物基底膜沉积电子致密物基底膜沉积 扫描电镜、透射电镜在材料科学特别纳米科学技术上的地位日益重要。稳定性、操作性的改善使得电镜不再是少数专家使用的高级仪器，而变成普及性的工具；更高分辨率依旧是电镜发展的最主要方向；扫描电镜和透射电镜的应用已经从表征和分析发展到原位实验和纳米可视加工；聚焦离子束(FIB)在纳米材料科学研究中得到越来越多的应用；FIB/SEM双束电镜是目前集纳米表征、纳米分析、纳米加工、纳米原型设计的最强大工具,2008年实现0.5分辨率
12、下的3D结构表征。正常细胞与凋亡和程序性坏死正常细胞与凋亡和程序性坏死冷冻电镜并不是这两年才建立的。在蛋白质X射线晶体学诞生大约10多年以后的1968年，作为里程碑式的电镜三维重构方法，同样在剑桥MRC分子生物学实验室诞生，Aron Klug教授因此获得了1982年的诺贝尔化学奖。另一些突破性的技术在上世纪70年代和80年代中叶诞生，主要是冷冻成像和蛋白快速冷冻技术。这里面的代表科学家有Ken Taylor,Robert Glaeser和Jacques Dubochet等。快速冷冻可以使蛋白质和所在的水溶液环境迅速从溶液态转变为玻璃态，玻璃态能使蛋白质结构保持其天然结构状态，如果以缓慢温和的方
13、式冷冻，这个过程会形成晶体冰，生物分子的结构将被晶格力彻底损坏。低剂量冷冻成像能够保存样品的高分辨率结构信息，确保了从电镜图形中解析蛋白质结构的可能性。与此同时Joachim Frank等则在电镜图像处理算法方面奠定和发展了这项技术的理论基础。2017年10月4日，2017年度诺贝尔化学奖授予给瑞士洛桑大学的Jacques Dubochet、美国哥伦比亚大学的Joachim Frank和英国剑桥大学分子生物学实验室的Richard Henderson，获奖理由是“开发出冷冻电子显微镜技术（cryo-electron microscopy,也称作electron cryomicroscopy,c
14、ryo-EM,也称为低温电子显微镜技术）用于确定溶液中的生物分子的高分辨率结构。”3.革命性的冷冻电镜技术革命性的冷冻电镜技术 冷冻电镜的基本建立过程为：1）样品冷冻（保持蛋白溶液态结构）；2）冷冻成像（获取二维投影图像）；3）三维重构（从二维图像通过计算得到三维密度图）。因为冷冻电子显微镜技术的出现，我们能看到的微观世界从图片左侧的样子，变成了右侧这样。图片来源：The Royal Swedish Academy of Sciences|制图：Martin Hgborn 冷冻电镜技术和三维重构技术是当前生物电子显微学的研究热点。冷冻电镜技术和三维重构技术是当前生物电子显微学的研究热点。低温电
15、低温电镜技术和三维重构技术是当前生物电子显微学的研究热点镜技术和三维重构技术是当前生物电子显微学的研究热点.主要是研讨利用低温电主要是研讨利用低温电子显微镜（其中还包括了液氦冷台低温电镜的应用）和计算机三维像重构技术，子显微镜（其中还包括了液氦冷台低温电镜的应用）和计算机三维像重构技术，测定生物大分子及其复合体三维结构。如利用冷冻电子显微学测定病毒的三维结测定生物大分子及其复合体三维结构。如利用冷冻电子显微学测定病毒的三维结构和在单层脂膜上生长膜蛋白二维晶体及其电镜观察和分析。三维结构决定功能构和在单层脂膜上生长膜蛋白二维晶体及其电镜观察和分析。三维结构决定功能结构是应用的基础结构是应用的基础:药物设计药物设计,基因改造基因改造,疫苗研制开发疫苗研制开发,人工构建蛋白等，有人预言人工构建蛋白等，有人预言结构生物学的突破将会给生物学带来革命性的变革。结构生物学的突破将会给生物学带来革命性的变革。新进展举例新进展举例 谢谢聆听谢谢聆听学习新技术,开拓新视野,为医学事业的发展努力!
